本文選題：豬　切入點(diǎn)：卵母細(xì)胞　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：豬卵母細(xì)胞冷凍保存作為豬種質(zhì)資源靜態(tài)保存的一個(gè)重要手段,受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。與人類(lèi)及小鼠、牛、羊等其他哺乳動(dòng)物相比,豬卵母細(xì)胞冷凍的效率仍然偏低,冷凍損傷機(jī)理的研究相對(duì)匱乏;要解決冷凍保存問(wèn)題,有必要深入研究冷凍機(jī)理。哺乳動(dòng)物胚胎或卵母細(xì)胞冷凍保存引發(fā)的細(xì)胞凋亡與線粒體損傷,被認(rèn)為是導(dǎo)致其凍后活力下降的主因。迄今為止,尚缺乏專(zhuān)門(mén)針對(duì)豬卵母細(xì)胞凍后凋亡情況、線粒體損傷和基因表達(dá)變化的系統(tǒng)研究。闡明卵母細(xì)胞凍后凋亡發(fā)生的主要途徑,對(duì)改善卵母細(xì)胞冷凍保存策略,提高凍后存活率與發(fā)育能力,具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。本研究首先通過(guò)觀察豬MⅡ期卵母細(xì)胞凍后線粒體分布、超微結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)基因表達(dá)的變化,系統(tǒng)研究冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞線粒體功能的影響;再利用Annexin V-FITC和FITC-VAD-FMK染色對(duì)冷凍卵母細(xì)胞分別進(jìn)行早期凋亡和總caspase活力檢測(cè),并對(duì)死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行分子和蛋白活性檢測(cè),初步闡明豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存后的細(xì)胞凋亡模式。由于凍后卵母細(xì)胞的恢復(fù)有助于提高其存活率和發(fā)育能力,本研究還通過(guò)觀察解凍后不同孵育培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬MⅡ期卵母細(xì)胞線粒體功能、細(xì)胞凋亡和發(fā)育能力的影響,以確定凍后的最佳體外培養(yǎng)時(shí)間;鑒于線粒體對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的重要作用及其在冷凍中的氧化損傷,本研究一方面利用抗氧化劑白藜蘆醇(Resveratrol,RES)添加于卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中,研究其對(duì)豬卵母細(xì)胞作用的最佳濃度和途徑,探討添加白藜蘆醇對(duì)豬卵母細(xì)胞抗凍能力的影響;另一方面,在凍后恢復(fù)液中,通過(guò)添加白藜蘆醇觀察卵母細(xì)胞凋亡和不同凋亡途徑中相關(guān)凋亡基因表達(dá)的情況,闡明凍后添加白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用及原理。此外,本研究還利用豬全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)冷凍前后的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行全基因組表達(dá)檢測(cè),篩選差異表達(dá)基因,并對(duì)其進(jìn)行GO和pathway分析,以尋找影響豬卵母細(xì)胞凍后損傷的關(guān)鍵分子與調(diào)控通路;為進(jìn)一步提高豬卵母細(xì)胞冷凍效率提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)參考。本研究共分6個(gè)部分,主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下。試驗(yàn)一、玻璃化冷凍對(duì)豬MⅡ期卵母細(xì)胞線粒體功能與凋亡的影響為了查明豬MⅡ期卵母細(xì)胞OPS(Open Pulled Straw,OPS)玻璃化冷凍后的線粒體損傷,闡明線粒體損傷在凋亡和凍后卵母細(xì)胞發(fā)育中的作用,本試驗(yàn)對(duì)凍后卵母細(xì)胞的線粒體膜電位(△Ψm值)、ROS(Reactive oxygen species,ROS)水平、ATP含量、線粒體分布、線粒體超微結(jié)構(gòu)、Annexin V-FITC染色的早期凋亡率、FDA染色存活率、孤雌激活發(fā)育率及線粒體相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)。結(jié)果表明:(1)凍后卵母細(xì)胞的線粒體膜電位值(1.05)顯著低于新鮮卵母細(xì)胞(1.24,P0.05);(2)玻璃化冷凍組卵母細(xì)胞ROS水平顯著高于對(duì)照組,其ATP含量則顯著低于對(duì)照組(P0.05);(3)Annexin V-FITC染色早期凋亡比例在OPS玻璃化冷凍組為57.6%,顯著高于新鮮卵母細(xì)胞對(duì)照組的8.53%(P0.05),OPS組的FDA染色存活率和孤雌激活卵裂率則顯著低于對(duì)照組(P0.05);(4)玻璃化冷凍不僅破壞了線粒體在卵母細(xì)胞的正常分布,并對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重的損害;(5)玻璃化冷凍后DNM1(Dynamin1,DNM1)基因表達(dá)量上調(diào),其他4個(gè)基因SOD1、Mfn2、BAX和Bcl2的表達(dá)則下調(diào)。綜上所述,玻璃化冷凍對(duì)豬MⅡ期卵母細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)和功能均產(chǎn)生顯著影響,早期細(xì)胞凋亡也在卵母細(xì)胞冷凍后被大量檢測(cè)到。線粒體內(nèi)源性凋亡途徑可能參與了豬卵母細(xì)胞凍后凋亡的發(fā)生。試驗(yàn)二、豬MⅡ期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的凋亡模式為闡明豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的細(xì)胞凋亡模式,本試驗(yàn)利用原位熒光染色技術(shù)對(duì)凍后卵母細(xì)胞死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中的關(guān)鍵caspase3、caspase8、caspase9和總caspase活性進(jìn)行檢測(cè),用RT-PCR技術(shù)對(duì)不同途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行mRNA表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果顯示,豬MⅡ期卵母細(xì)胞冷凍后,無(wú)論是死亡受體外源性凋亡途徑的caspase 8熒光強(qiáng)度值(32.03),還是線粒體內(nèi)源性凋亡途徑的caspase 9熒光強(qiáng)度值(16.56),以及兩者共同途徑中的caspase 3和總caspase熒光強(qiáng)度值(16.70和8.43)均顯著高于新鮮卵母細(xì)胞對(duì)照組所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值(分別為4.02、4.83、4.23和3.08;P0.05)。死亡受體外源性凋亡途徑TNFα(Tumor necrosis factor-α,TNFα)、FasL(Fas ligand,FasL)、CASP8和CASP3基因表達(dá)量也均有一定水平的提高,線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑中,CASP9、CASP3和P53基因表達(dá)水平呈上升趨勢(shì),而B(niǎo)cl2、BAX、SOD1和survivin的基因表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。綜上所述,死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡共同參與了豬MⅡ期卵母細(xì)胞凍后的凋亡過(guò)程。試驗(yàn)三、體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬MⅡ期卵母細(xì)胞凍后線粒體功能、凋亡與發(fā)育的影響本試驗(yàn)旨在確定豬卵母細(xì)胞冷凍-解凍后的最佳體外培養(yǎng)時(shí)間。豬卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍-解凍后分別體外培養(yǎng)0、1、2和4h,然后進(jìn)行線粒體膜電位、ATP含量、ROS水平、早期凋亡比例、總caspase水平、FDA染色存活率和孤雌激活卵裂率檢測(cè)。結(jié)果顯示:(1)卵母細(xì)胞冷凍-解凍后培養(yǎng)2和4 h,線粒體膜電位值分別為1.19和1.26,雖顯著低于新鮮卵母細(xì)胞(1.34;P0.05),但與培養(yǎng)1 h組的線粒體膜電位值(1.06)相比有顯著提高(P0.05);(2)ROS水平在凍后培養(yǎng)1 h卵母細(xì)胞表現(xiàn)為最高(69.54),增加凍后培養(yǎng)時(shí)間,ROS水平則有下降趨勢(shì),其中以培養(yǎng)2 h最低(52.81);ATP含量也表現(xiàn)為在凍后1 h最低,延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至2和4 h,ATP含量逐漸升高;(3)在早期凋亡中,Annexin V-FITC染色結(jié)果表明,凍后卵母細(xì)胞凋亡陽(yáng)性比例在體外培養(yǎng)2 h組最低(43.18%),總caspase水平在卵母細(xì)胞凍后培養(yǎng)1 h組最高,達(dá)17.28;延長(zhǎng)恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間至2 h,caspase水平顯著下降(4.38);(4)凍后卵母細(xì)胞FDA染色存活率隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)為持續(xù)下降,但孤雌激活卵裂率卻表現(xiàn)為升高趨勢(shì),其中以培養(yǎng)2 h組最高(19.84%),繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至4 h,卵裂率有所下降。試驗(yàn)四、體外成熟液中添加白藜蘆醇對(duì)豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育、抗凍能力與基因表達(dá)的影響為探究成熟培養(yǎng)液中添加白藜蘆醇對(duì)豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育與抗凍能力的影響及作用機(jī)理,本試驗(yàn)在成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的白藜蘆醇,觀察對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟與發(fā)育能力的影響;利用RT-PCR技術(shù)分析成熟卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中凋亡相關(guān)基因的表達(dá);對(duì)白藜蘆醇處理前后的MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍,通過(guò)對(duì)線粒體膜電位、ATP含量、ROS水平、早期凋亡和發(fā)育能力的檢測(cè),研究白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞抗凍能力的影響及機(jī)制。結(jié)果表明:(1)成熟培養(yǎng)液中添加2到5μM白藜蘆醇有利于提高豬卵母細(xì)胞體外成熟率和發(fā)育能力,提高白藜蘆醇濃度至10μM則表現(xiàn)為細(xì)胞毒性作用;(2)添加2μM白藜蘆醇可提高卵母細(xì)胞MATER(胚胎所需的母源抗原,maternal antigen that embryos require)基因表達(dá)量,并降低c-mos表達(dá),同時(shí)它還能增加Sirt1(Silent mating type information regulation 2 homolog 1,Sirt1)基因的表達(dá),并降低凋亡相關(guān)基因的表達(dá);當(dāng)白藜蘆醇添加量增至10μM時(shí),卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)呈現(xiàn)出促凋亡狀態(tài);(3)添加白藜蘆醇后,成熟卵母細(xì)胞凍后FDA染色存活率和孤雌激活卵裂率均高于未添加組,早期凋亡率則低于未添加組;(4)添加白藜蘆醇后,成熟卵母細(xì)胞在冷凍前后的ROS水平均要低于未添加組,ATP含量和線粒體膜電位值則高于未添加組。綜上所述,在豬卵母細(xì)胞成熟液中添加2～5μM白藜蘆醇,可通過(guò)提高線粒體功能,降低促凋亡相關(guān)基因和增加抑凋亡相關(guān)基因的表達(dá),達(dá)到提高孤雌激活胚發(fā)育、增加抗凍能力的目的;但高濃度(10μM)白藜蘆醇則表現(xiàn)為嚴(yán)重的細(xì)胞毒性作用。試驗(yàn)五、白藜蘆醇處理對(duì)豬MⅡ期卵母細(xì)胞凍后凋亡與相關(guān)基因表達(dá)的影響本試驗(yàn)側(cè)重研究在凍后恢復(fù)液中添加白藜蘆醇對(duì)豬卵母細(xì)胞凍后凋亡與存活率的影響,并探討其作用機(jī)制。在豬MⅡ期卵母細(xì)胞凍后恢復(fù)液中添加2μM白藜蘆醇,通過(guò)檢測(cè)線粒體膜電位、ATP含量、ROS水平、凋亡狀態(tài)與發(fā)育能力,以及不同凋亡途徑相關(guān)基因的表達(dá),研究白藜蘆醇對(duì)豬卵母細(xì)胞抗凍能力的影響和作用機(jī)理。結(jié)果表明:(1)凍后添加白藜蘆醇可顯著提高線粒體膜電位水平,增加細(xì)胞內(nèi)ATP含量,并降低ROS水平;(2)凍后添加白藜蘆醇后,卵母細(xì)胞早期凋亡比例由46.8%下降至39.0%,總caspase水平也由未添加組的4.38下降至3.01(P0.05);(3)凍后添加白藜蘆醇可顯著提高豬卵母細(xì)胞FDA染色存活率和孤雌激活胚卵裂率;(4)凋亡相關(guān)基因表達(dá)研究表明,添加白藜蘆醇可提高線粒體功能相關(guān)基因(SOD1和DNM1)表達(dá)水平;并通過(guò)同時(shí)改善死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡,降低細(xì)胞的凋亡水平。綜上所述,在凍后卵母細(xì)胞中添加白藜蘆醇可同時(shí)改善死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑,從而減少細(xì)胞凋亡,提高凍后卵母細(xì)胞發(fā)育率。試驗(yàn)六、豬MⅡ期卵母細(xì)胞凍后全基因組表達(dá)譜分析用豬全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)MⅡ期卵母細(xì)胞冷凍后基因表達(dá)譜進(jìn)行分析,篩選影響卵母細(xì)胞冷凍的關(guān)鍵基因和相應(yīng)的調(diào)控通路。結(jié)果表明:(1)豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后全基因組表達(dá)譜芯片分析中共獲得2倍以上差異基因171個(gè),其中上調(diào)基因103個(gè),下調(diào)基因68個(gè);(2)損傷應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞壞死及蛋白激酶調(diào)節(jié)、RNA拼接、細(xì)胞核mRNA拼接、mRNA代謝等參與了卵母細(xì)胞凍后基因差異表達(dá)的生物學(xué)過(guò)程;(3)胞外區(qū)分離、基底質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜斷裂、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、線粒體斷裂、線粒體、細(xì)胞器膜和線粒體包膜等參與了卵母細(xì)胞凍后基因差異表達(dá)的細(xì)胞組分調(diào)控;(4)Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路均參與了豬卵母細(xì)胞凍后基因表達(dá)的調(diào)控。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S828
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本文編號(hào)：1684953