本文選題：副豬嗜血桿菌　切入點：OMP　出處：《河北農(nóng)業(yè)大學》2013年碩士論文

【摘要】：副豬嗜血桿菌�。℉aemophilus parasuis，Hps）又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，也稱革拉瑟氏�。℅lasser’s disease），由副豬嗜血桿菌引起。副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在菌，，在正常條件下不表現(xiàn)任何臨床癥狀，但在特定條件下可引起嚴重的全身性疾病。該菌在環(huán)境中普遍存在，世界各地都有。近些年來隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的新發(fā)細菌性傳染病，它常作為繼發(fā)的病原菌和其它主要病原混合感染，給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，故建立快速、準確的檢測方法是成功防治該病的關(guān)鍵。 目前針對副豬嗜血桿菌的檢測方法主要有細菌分離培養(yǎng)、免疫學（抗體監(jiān)測）方法及PCR法。但副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)操作極其繁瑣，檢測所需時間長且靈敏度低；免疫學方法的靈敏度也不理想，PCR法雖敏感、快速但其需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，使其很難在基層推廣應(yīng)用。 環(huán)介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是由日本科學家Notomi研發(fā)的新型核酸擴增技術(shù)，它能夠在恒溫條件下特異性地擴增靶序列，該法以高效、快速且成本低廉、操作簡便等優(yōu)點迅速在諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 本試驗是采用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測副豬嗜血桿菌，以副豬嗜血桿菌的高保守序列OMP P2基因序列（NZ_ABKM01000007.1）為靶基因，根據(jù)LAMP引物設(shè)計的原則，應(yīng)用Primer Explorer3.0軟件針對6個特定區(qū)域，設(shè)計出4條特異性引物。在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，對模板DNA進行等溫擴增，并對LAMP反應(yīng)體系中內(nèi)外（F3:FIP和B3:BIP）引物、MgSO4、dNTP及Bst酶的濃度、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度等擴增條件進行優(yōu)化，最終確定了25μL的LAMP最佳反應(yīng)體系：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6mmol/L，外引物（F3和B3）各0.2mmol/L；鎂離子的濃度為3.0mmol/L；dNTP濃度為3.0mmol/L；8U的BstDNA聚合酶的添加量為0.8μL，2.5μL10×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2μLDNA模板，并用無菌雙蒸水補足體系。LAMP的基本反應(yīng)過程為：先將反應(yīng)混合物置于62℃水浴鍋中反應(yīng)40min，然后在80℃水浴鍋中水浴10min終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀來判斷LAMP反應(yīng)是否發(fā)生，亦可加入熒光染料或用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 以PCR方法作為對照，測定LAMP法的靈敏度。結(jié)果表明， PCR最低檢測DNA量為20pg/μL；而LAMP最低檢測DNA量為0.2pg/μL，LAMP比PCR方法敏感100倍；同時利用LAMP方法對豬胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒以及豬肺炎支原體9種常見病原進行特異性試驗，結(jié)果表明，9種病原體LAMP反應(yīng)均為陰性，說明LAMP方法具有良好的特異性。 綜上，本試驗建立的LAMP體系為檢測副豬嗜血桿菌提供了快速、靈敏、特異高效的檢測方法。該法操簡便易行，對操作人員技術(shù)水平要求并不高且不需要昂貴的儀器設(shè)備，對于基層和實驗室應(yīng)用均具有良好前景。
[Abstract]:In recent years , with the development of the world ' s pig industry , the disease has become a new bacterial infectious disease affecting the development of pig industry worldwide .

At present , the detection method for the parasporis mainly includes the bacteria separation culture , the immunology ( antibody monitoring ) method and the PCR method , but the separation and culture operation of the parasporcini is extremely complicated , the required time is long and the sensitivity is low ;
The sensitivity of immunological method is not ideal , PCR method is sensitive , rapid , but it needs expensive instruments and equipment and complicated process , which makes it difficult to popularize and apply in the base course .

Loop - mediated isothermal amplification ( LAMP ) is a new nucleic acid amplification technology developed by Notomi , a Japanese scientist , which can amplify the target sequence at constant temperature . The method is widely used in many fields with the advantages of high efficiency , fast and low cost , simple operation and the like .

According to the principle of LAMP primer design , four specific primers were designed according to the principle of LAMP primer design .
the concentration of magnesium ions is 3.0 mmol / L ;
the concentration of dps is 3.0 mmol / L ;
8U BstDNA polymerase was added in 0.8 渭L , 2.5 渭L 脳 BstDNA polymerase reaction buffer and 2 渭L DNA template . The basic reaction procedure of LAMP was to put the reaction mixture in a water bath at 62 鈩

本文編號：1682724