本文選題：神經(jīng)回路　切入點(diǎn)：病毒示蹤工具　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：神經(jīng)回路的結(jié)構(gòu)和功能是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的核心問(wèn)題�！犊茖W(xué)》雜志在2012年底將腦連接組學(xué)列為當(dāng)今6大最值得關(guān)注的科學(xué)領(lǐng)域之一。神經(jīng)回路的解析依賴于神經(jīng)回路示蹤系統(tǒng)。目前,嗜神經(jīng)病毒是運(yùn)用最廣泛的神經(jīng)回路示蹤工具,其具備以下特點(diǎn):(1)可以跨突觸傳播;(2)可以控制病毒跨突觸傳播的方向?yàn)轫樞谢蚰嫘?(3)跨突觸以后病毒可以復(fù)制,因此信號(hào)不會(huì)衰減;(4)可以插入多種目的基因,對(duì)其基因組進(jìn)行改造。盡管嗜神經(jīng)病毒如狂犬病毒、偽狂犬病毒以及水皰性口炎病毒等作為神經(jīng)回路特異示蹤工具來(lái)追蹤傳入性環(huán)路的技術(shù)已較為成熟,但其毒性、跨突觸特性、嗜神經(jīng)性和安全性方面存在較大的缺陷。本課題旨在構(gòu)建一套用于直接示蹤神經(jīng)元傳入性環(huán)路變化的新型病毒示蹤工具。本研究選用嗜神經(jīng)病毒示蹤工具中應(yīng)用最多的狂犬病毒,即在狂犬病毒疫苗株(SAD毒株)的基礎(chǔ)上,改造病毒的基因組,敲除特定的毒力基因(G蛋白),并對(duì)該毒力基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,并插入可變色熒光蛋白等外源基因,獲得低毒力、使用安全、攜帶標(biāo)記物的重組示蹤工具病毒系統(tǒng),以期用于直接示蹤神經(jīng)元傳入性環(huán)路變化。本研究獲得以下結(jié)果:1、構(gòu)建并驗(yàn)證慢速變色熒光蛋白構(gòu)建了慢速變色熒光蛋白(slow fluorescent timer,slow FT),并將該基因插入了腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV),包裝的r AAV-CMV-Slow FT感染細(xì)胞,感染后12小時(shí),藍(lán)色熒光逐漸達(dá)到最大值,并出現(xiàn)紅色熒光,感染后24小時(shí),藍(lán)色熒光逐漸消失,紅色熒光逐漸達(dá)到最大值。2、構(gòu)建并驗(yàn)證Tet-on和蛋白降解元件雙調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了用Tet-on和DD(Destabilizing Domain)基因共同調(diào)控目的基因表達(dá)的雙調(diào)控體系。對(duì)于Tet-on系統(tǒng)的反應(yīng)元件、調(diào)控元件與DD的組合,進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。最終將Tet-on的反應(yīng)元件TREtight與DD插入同一質(zhì)粒骨架AAV基因組內(nèi),調(diào)控元件rt TA插入狂犬病毒基因組中。該雙調(diào)控表達(dá)體系,不僅具有反應(yīng)快,效率高,可逆轉(zhuǎn)等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)極大地降低了單一的調(diào)控系統(tǒng)漏表達(dá)情況。該系統(tǒng)在體內(nèi)和體外均得到了良好的驗(yàn)證。3、構(gòu)建了使用雙調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控的G蛋白AAV輔助病毒體系雙調(diào)控基因表達(dá)體系建立的目的是為了調(diào)控狂犬病毒的毒力基因G蛋白的表達(dá)。本課題針對(duì)狂犬病毒不同毒株(包括山西株、安徽株、疫苗株SAD、N2C)的G蛋白,構(gòu)建了不同的AAV輔助病毒體系。其目的是為了比較不同強(qiáng)弱毒株G蛋白的毒力大小,對(duì)該缺失G蛋白的狂犬假病毒的毒性和嗜神經(jīng)性等進(jìn)行優(yōu)化,以期選取毒性最小,同時(shí)又具備高嗜神經(jīng)性的狂犬假病毒示蹤工具。4、表達(dá)變色熒光蛋白的狂犬病毒的構(gòu)建、拯救及活體驗(yàn)證基于病毒的反向遺傳操作系統(tǒng),構(gòu)建了缺失G蛋白的狂犬病毒并在該部位插入慢速變色熒光蛋白。病毒拯救成功,用三維立體定位儀將病毒注射到鼠腦的海馬區(qū),驗(yàn)證了其熒光蛋白顏色的變化。5、VSV-SAD嵌合糖蛋白狂犬假病毒的包裝為了能使狂犬病毒在鼠腦的注射區(qū)域更多的感染神經(jīng)元的胞體,從而更好的示蹤注射區(qū)域的神經(jīng)回路,本課題用水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis vitus,VSV)和狂犬病毒嵌合的G蛋白(VSV-SAD G)包裝出了狂犬假病毒。用CRISPR技術(shù)對(duì)B7GG細(xì)胞系進(jìn)行改造,敲除細(xì)胞基因組中的綠色熒白GFP基因,插入藍(lán)色熒光蛋白BFP和嵌合G蛋白,該細(xì)胞系的改造正在進(jìn)行�；谑壬窠�(jīng)病毒發(fā)展而來(lái)的跨突觸追蹤技術(shù),是揭示大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的最有效手段,也是神經(jīng)科學(xué)研究中發(fā)展十分迅速的領(lǐng)域。對(duì)于本課題中可調(diào)控神經(jīng)回路示蹤體系的建立,有望能為研究鼠腦中神經(jīng)回路的變化或狂犬病毒的感染過(guò)程等提供一定的幫助。
[Abstract]:A new type of virus tracing tool for the direct tracing of neuronal afferent loop has been constructed and verified . In order to improve the expression of G protein of rabies virus , it has been proved that it is the most effective way to control rabies virus ' s virulence gene G protein .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 宋艷;李寧;黃飛;單晶輝;張茂林;段銘;關(guān)振宏;;狂犬病毒作為神經(jīng)示蹤劑的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年05期

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本文編號(hào)：1677501