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  本文關(guān)鍵詞：綿羊肺炎霉形體的培養(yǎng)與保存，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2007年

綿羊肺炎霉形體的培養(yǎng)純化研究與間接ELISA檢測抗體方法的初步建立

易佳  

【摘要】： 綿羊肺炎霉形體(MO)所致綿羊肺炎霉形體病是目前羊場中發(fā)病率和致死率最高的疾病之一。本研究通過對綿羊肺炎霉形體進行菌株純化，對比不同培養(yǎng)基，含不同血清的對比培養(yǎng)基和含不同抗生素濃度的對比培養(yǎng)基對綿羊肺炎霉形體生長的影響，從而純化了綿羊肺炎霉形體菌株Y；優(yōu)化篩選出以加入10％的豬血清和正�？股貪舛菷M-4培養(yǎng)基培養(yǎng)綿羊肺炎霉形體效果最好，為進一步研究其病原學(xué)和致病機理打下基礎(chǔ)。 在改良FM-4液體培養(yǎng)基中接種綿羊肺炎霉形體，48h后收集菌體，經(jīng)蛋白酶抑制劑處理；通過抗原提取方法的篩選，采用低滲-凍融-超聲裂解法獲得MO菌體蛋白作為包被抗原，，初步建立了檢測該病抗體的間接ELISA方法。通過試驗比較，確定了ELISA的最佳反應(yīng)條件為：抗原包被濃度為17.5μg/ml；以含1％BSA的PBST為最佳封閉液，37℃反應(yīng)2h；血清最佳工作濃度為1:320，37℃反應(yīng)1h；酶標羊抗兔IgG的最佳工作濃度為1:5000，37℃反應(yīng)1h；陰陽性臨界值為0.084。菌體蛋白能阻斷陽性血清與相應(yīng)包被抗原的反應(yīng)；與絲狀支原體山羊亞種陽性血清、布氏桿菌陽性血清、鏈球菌C群陽性血清均無交叉反應(yīng)；表明特異性好。包被好的反應(yīng)板4℃保存3個月，其靈敏度不變。間接ELISA能夠檢測出的血清最高效價為1:2560，而間接血凝試驗?zāi)軝z測的最高效價僅為1:64。建立的間接ELISA檢測綿羊肺炎霉形體抗體方法，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，適用于該病的診斷與疫病普查。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：S852.62
【目錄】：

中文摘要7-8

Abstract8-9

文獻綜述9-16

1 歷史與分布9-10

2 病原學(xué)10

2.1 分類及形態(tài)特性10

2.2 培養(yǎng)特性10

3 抗原結(jié)構(gòu)10-11

4 流行病學(xué)11

5 臨床癥狀及病理變化11-12

5.1 臨床癥狀11-12

5.2 病理變化12

6 診斷方法12-14

6.1 病原學(xué)培養(yǎng)診斷12-13

6.2 血清學(xué)檢測13-14

6.3 分子生物學(xué)診斷14

7 防治14-16

7.1 藥物治療14-15

7.2 防制措施15-16

研究目的意義16-17

材料與方法17-23

1 材料17

1.1 菌株17

1.2 血清17

1.3 試劑17

1.4 儀器17

2 方法17-23

2.1 綿羊肺炎霉形體菌株純化17

2.2 綿羊肺炎霉形體培養(yǎng)條件優(yōu)化17-18

2.3 綿羊肺炎霉形體菌體的收集18-19

2.4 綿羊肺炎霉形體菌體全蛋白的制備19-20

2.5 兔抗綿羊肺炎霉形體陰性和陽性血清的制備20

2.6 間接ELISA的操作方法20-21

2.7 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的選擇21

2.8 間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定21-22

2.9 特異性試驗22

2.10 重復(fù)性試驗22

2.11 保存期試驗22

2.12 敏感試驗22-23

結(jié)果23-32

1 綿羊肺炎霉形體的培養(yǎng)純化23-25

1.1 綿羊肺炎霉形體的菌株純化23-24

1.2 綿羊肺炎霉形體培養(yǎng)條件優(yōu)化24-25

2 菌體全蛋白的制備方法25-26

3 兔抗綿羊肺炎霉形體陰性和陽性血清的制備26-27

4 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的選擇27-29

4.1 最佳抗原和血清工作濃度的選擇27

4.2 酶標羊抗兔IgG最佳工作濃度的選擇27-28

4.3 酶標羊抗兔IgG最佳工作時間的選擇28

4.4 不同封閉液及封閉時間的選擇28

4.5 陰性、陽性血清最適反應(yīng)時間的選擇28-29

5 間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定29

6 特異性試驗29-31

6.1 阻斷試驗29-30

6.2 交叉反應(yīng)試驗30-31

8 保存期試驗31

9 敏感試驗31-32

討論32-35

結(jié)論35-36

參考文獻36-42

致謝42-43

攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表文章目錄43

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【引證文獻】

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