本文選題：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)　切入點(diǎn)：Nsp10　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒科正鏈RNA病毒。自1990年被發(fā)現(xiàn)以來,豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)迅速成為豬產(chǎn)業(yè)最重要的病毒疾病之一。它主要表現(xiàn)為母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎或弱仔;公豬精液品質(zhì)下降;初生仔豬高死亡率;其它年齡豬呼吸系統(tǒng)疾病。這個(gè)病毒還在繼續(xù)進(jìn)化,變異的病毒毒力增強(qiáng)導(dǎo)致大批豬死亡和流產(chǎn),甚至引起非典型的豬繁殖與呼吸綜合征。在防治PRRS可行的策略中,疫苗是控制PRRSV感染最主要的方法。然而目前市面上使用的滅活疫苗和減毒疫苗都不能有效控制PRRSV的感染。另外PRRSV感染本身會(huì)延緩中和抗體的出現(xiàn)以及導(dǎo)致宿主T細(xì)胞免疫反應(yīng)的削弱,這也是疫苗免疫效果差的原因。因此很有必要找到控制PRRSV的有效方法。動(dòng)脈炎病毒Nsp10蛋白參與病毒增殖的很多過程,包括sgRNA的合成、mRNA的早期轉(zhuǎn)錄、基因組復(fù)制和病毒粒子的生成。將高致病性PRRSV毒株和弱毒株的基因組序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)Nsp10蛋白的突變可能與病毒的毒力相關(guān)。而除了2002年報(bào)道過PRRSV Nsp10的功能特性之后,以后的十幾年里鮮有報(bào)道。因此,開展Nsp10蛋白的關(guān)鍵活性位點(diǎn)的研究及酶抑制劑的篩選,對(duì)于解開Nsp10蛋白的解旋機(jī)制和抗PRRSV藥物的開發(fā)有重要指導(dǎo)意義。本研究首先通過原核表達(dá)并使用鎳柱親和層析純化獲得高活性的Nsp10解旋酶,使用化學(xué)發(fā)光試劑盒和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法建立測(cè)定Nsp10蛋白ATP水解活性和解旋活性的最佳檢測(cè)體系。并且構(gòu)建了一系列Nsp10蛋白突變體。通過測(cè)定它們的活性,分析Nsp10蛋白保守基序Ⅰ和Ⅱ中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。而且進(jìn)一步建立解旋酶抑制劑高通量篩選體系;對(duì)SPECS公司碎片庫(kù)的4536種化合物碎片進(jìn)行篩選,找到抑制Nsp10蛋白解旋活性的小分子化合物。最后測(cè)定這些化合物在細(xì)胞水平上的抗病毒活性。另外,本研究中還為解析Nsp10蛋白的結(jié)構(gòu)作出了努力。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.Nsp10蛋白的原核表達(dá)、親和層析純化和活性檢測(cè)體系的確定經(jīng)過對(duì)表達(dá)條件的篩選,最終確定Nsp10蛋白在原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Nsp10中,16。C誘導(dǎo)16h可表達(dá)于上清之中。通過鎳柱親和層析純化獲得了較純的Nsp10融和蛋白并用SDS-PAGE膠和Western blot進(jìn)行了鑒定。然后,用Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assay Kit檢測(cè)Nsp10蛋白ATPase活性,通過對(duì)各種條件的摸索建立了最佳反應(yīng)體系,即反應(yīng)溫度37。C、反應(yīng)時(shí)間30min、緩沖液條件為pH7.9、2mM MgCl2、0.6μM Nsp10蛋白和0.2mM ATP。并發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中純化得到的Nsp10蛋白中本身螯合一定量的金屬離子。同時(shí),利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理建立Nsp10蛋白解旋活性的最佳檢測(cè)體系:反應(yīng)溫度37。C,反應(yīng)時(shí)間90min,緩沖液條件為pH7.9、2mM MgCl2、80μM Nsp10蛋白、400 nM雙鏈熒光底物、4μM捕獲鏈和0.2mM ATP。2.Nsp10蛋白保守基序Ⅰ和Ⅱ中的關(guān)鍵活性位點(diǎn)的研究通過重疊PCR定點(diǎn)突變Nsp10蛋白的不同位點(diǎn)獲得一系列突變體,檢測(cè)突變體蛋白的ATPase和解旋活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變體蛋白K155A和E226A的ATP水解活性分別下降了88.1%和8.0%。其他位點(diǎn)氨基酸的突變幾乎不影響Nsp10蛋白的ATP水解活性。證明了Nsp10蛋白K155氨基酸是ATPase活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。突變體蛋白K155A、D225A、E226A、A228V和A228D的解旋活性均有所下降。其中突變體蛋白D225A和A227S的解旋活性分別下降了77.0%和99.3%。突變體蛋白D225A和E226A的ATP水解活性和解旋活性都顯著減弱。當(dāng)227位的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸時(shí),蛋白的解旋活性幾乎喪失;而當(dāng)突變?yōu)槔i氨酸的時(shí)候,蛋白的解旋活性反而增強(qiáng)。結(jié)果說明D225和E226氨基酸與ATP水解和雙鏈解旋過程都有關(guān)聯(lián);A227氨基酸是解旋活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。3.解旋酶抑制劑的高通量篩選和細(xì)胞水平上驗(yàn)證化合物的抗病毒活性建立高通量篩選模型,從SPECS公司4536種小分子碎片中篩選得到能抑制Nsp10蛋白的解旋活性且抑制率大于50%的18種化合物。將這18種化合物進(jìn)行細(xì)胞水平的抗病毒活性研究,發(fā)現(xiàn)沒有明顯的抑制病毒增殖感染的作用。4.Nsp10蛋白結(jié)構(gòu)的研究將通過Ni柱親和層析純化得到的Nsp10蛋白,再通過凝膠過濾層析使得蛋白純度達(dá)到95%以上。將高純度Nsp10蛋白使用超濾管濃縮至濃度大于5mg/ml,然后對(duì)蛋白結(jié)晶條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化。最后發(fā)現(xiàn)Nsp10蛋白在2.2M NaCl,1.0M HEPES pH7.5的緩沖液中可以長(zhǎng)出圓柱形質(zhì)量較好的晶體;但是晶體分辨率最好只有3.6?,還不能解析Nsp10的結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1668937