本文選題：奶牛　切入點(diǎn)：小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：本試驗(yàn)研究了奶牛各組織小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(proton-dependent oligopeptide transporters, POTs)的表達(dá),并通過二肽培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞系(bovine mammary epithelial cell, BMEC),研究小肽對BMEC乳蛋白合成的影響。為POTs在奶牛組織中的功能性研究提供依據(jù),并為小肽在BMEC中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供參考。研究包含3個(gè)試驗(yàn),具體如下：[試驗(yàn)一]研究POTs在奶牛乳腺組織(mammary gland, MG)及BMEC中的定位和表達(dá)分析。在無菌條件下分離脂肪較少且富含乳腺小葉的MG進(jìn)行純化培養(yǎng),應(yīng)用免疫熒光法研究PepT1和PepT2蛋白在MG及BMEC中的分布,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法研究PepT1和PepT2在MG及BMEC中的表達(dá)。結(jié)果表明,PepT1分布于MG的小葉間結(jié)締組織,PepT2分布于MG的乳導(dǎo)管及腺泡腔上皮細(xì)胞；PepT1和PepT2均分布于BMEC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn),PepT1和PepT2在MG和BMEC中均有表達(dá)。[試驗(yàn)二]研究POTs在奶牛組織中的定量分析。屠宰4頭健康的3月齡荷斯坦?fàn)倥?采集奶牛心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胸腺、乳腺(采自2頭泌乳后期淘汰奶牛)、肌肉組織及瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸的黏膜層。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究PepT1、PepT2、PHT1和PHT2 mRNA在各組織中的表達(dá)差異。結(jié)果表明,PepT1 mRNA在奶�？漳c和十二指腸中表達(dá)量極顯著高于回腸、瘤胃、.肺臟、結(jié)腸、瓣胃、肝臟、盲腸、網(wǎng)胃、胸腺、脾臟、皺胃、腎臟、乳腺、心臟和肌肉(P0.01)；PepT2 mRNA在奶牛乳腺中表達(dá)量極顯著高于腎臟、肝臟、肺臟、脾臟、回腸、皺胃、胸腺、十二指腸、網(wǎng)胃、盲腸、心臟、空腸、結(jié)腸、瓣胃、肌肉和瘤胃(P0.01)；PHT1 mRNA在奶牛脾臟、盲腸和肺臟中表達(dá)量極顯著高于心臟和肌肉(P0.01)；PHT2 mRNA在奶牛肺臟、盲腸和胸腺中表達(dá)量極顯著高于瘤胃、皺胃、網(wǎng)胃、心臟和肌肉(P0.01)。[試驗(yàn)三]研究二肽對BMEC乳蛋白合成的影響。不同濃度Met-Met、Val-Met和Leu-Met分別培養(yǎng)BMEC,在最佳二肽濃度基礎(chǔ)上,試驗(yàn)分為二肽組(Met-Met, Val-Met, Leu-Met),1/2二肽+1/2氨基酸組(Met-Met/Met、Met、Val-Met/Val、Met、Leu-Met/Leu、 Met),氨基酸組(Met、Met、Val、Met、Leu、Met),分別刺激培養(yǎng)BMEC,比較研究蛋白合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)差異。結(jié)果表明：Met-Met/Met、Met組mTOR、EIF-4E、 S6K1和SOCS-3基因表達(dá)量極顯著高于Met-Met組和Met、Met組(P0.01)。Val-Met/Val、 Met組K-酪蛋白、EIF-4E mRNA表達(dá)量極顯著高于Val-Met組和Val、Met組(P0.01)：Val-Met/Val、Met組PepT2 mRNA表達(dá)量顯著高于Val-Met組和Val、Met組(P0.05);Leu-Met組PHT1 mRNA表達(dá)量顯著高于Leu-Met/Leu、Met組(P0.05),Leu-Met/Leu、Met組K-酪蛋白mRNA表達(dá)量極顯著高于Leu-Met組和Leu、Met組(P0.01),Leu-Met組EIF-4E mRNA表達(dá)量顯著高于Leu、Met組(P0.05)。HPLC檢測BMEC培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中二肽濃度變化,Met-Met/Met、Met組和Leu-Met/Leu、Met組二肽消失量高于Met-Met組和Leu-Met。結(jié)論：(1)PepT1分布于奶牛MG小葉間結(jié)締組織；PepT2分布于MG葉間導(dǎo)管及腺泡腔內(nèi)側(cè)上皮細(xì)胞。(2)PepT1和PepT2蛋白分布于BMEC的細(xì)胞質(zhì)。(3)PepT1在奶�？漳c和十二指腸,PepT2在乳腺,PHT1在脾臟、盲腸和胸腺,PHT2在肺臟、盲腸和胸腺中mRNA表達(dá)量最高。(4)二肽與氨基酸混合培養(yǎng)可促進(jìn)乳K-酪蛋白和蛋白合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄：(5)Met、Val和Leu可促進(jìn)BMEC對Met-Met、Val-Met和Leu-Met二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。
[Abstract]:The study of small peptide transporter organizations (proton-dependent oligopeptide transporters, POTs cow) expression, and by two peptide cultured bovine mammary epithelial cell line (bovine mammary epithelial cell, BMEC), the research of small peptide ring effect on milk protein synthesis of BMEC. To provide the basis for the functional studies of POTs in cow tissues, and provide a reference for the transport mechanism of small peptide in BMEC. The study included 3 experiments as follows: [a] Experimental Study of POTs in mammary tissue (mammary gland, MG) and the analysis of the location and expression of BMEC. The separation of less fat and rich in mammary glands under sterile conditions were purified and cultured MG immunofluorescence was used to study the distribution, PepT1 and PepT2 protein in MG and BMEC's expression by fluorescence quantitative real-time PCR and Western blot and PepT2 PepT1 method in MG and BMEC. The results show that the distribution of PepT1 In MG the interlobular connective tissue, the distribution of PepT2 in MG breast ductal and acinar epithelial cells; PepT1 and PepT2 BMEC were distributed in the cytoplasm and cell membrane; real time fluorescence quantitative PCR and Western blot analysis, quantitative analysis in cow tissue PepT1 and PepT2 in both MG and BMEC expression in experiment two. Study POTs. Slaughter 4 healthy 3 month old Holstein calves, collecting cow heart, liver, lung, kidney, spleen, thymus, breast (collected from 2 lactating cows, late elimination) of muscle tissue and rumen, reticulum, omasum, abomasum, twelve duodenal, jejunum, ileum, cecum, colon mucosa the application of real time fluorescence quantitative PCR analysis of PepT1, PepT2, PHT1 and PHT2 mRNA expression in different tissues. The results showed that the expression of PepT1 mRNA in the jejunum and duodenum of dairy cattle was much higher than that of ileum, rumen. Lung, colon, liver, omasum, cecum, net The stomach, thymus, spleen, kidney, breast, abomasum, heart and muscle (P0.01); the expression of PepT2 mRNA in cow mammary gland volume was significantly higher than that of kidney, liver, lung, spleen, thymus, abomasum, ileum, duodenum, stomach, jejunum, cecum, colon, heart, muscle of rumen and omasum, (P0.01 PHT1; mRNA) in bovine spleen and lung, expression of cecum was much higher than that in heart and muscle (P0.01); PHT2 mRNA in cow lung, expression of cecum and thymus weight were significantly higher than that of rumen, abomasum, stomach, heart and muscle (P0.01) three] effect of two peptide synthesis on BMEC milk protein "test. Different concentrations of Met-Met, Val-Met and Leu-Met were cultured in BMEC, the optimal concentration of two peptide on the basis of the experiment was divided into two groups (Met-Met, Val-Met peptide, Leu-Met), 1/2 two (Met-Met/Met, +1/2 peptide amino acids Met, Val-Met/Val, Met, Leu-Met/Leu, Met), amino acids (Met, Met, Val group Met, Leu, Met. ), were cultured BMEC, comparative study on protein synthesis related gene mRNA expression. The results showed that: Met-Met/Met, EIF-4E, Met group mTOR, S6K1 and SOCS-3 gene expression was significantly higher than that in Met-Met group and Met group (P0.01), Met.Val-Met/Val, Met K- EIF-4E group of casein, the expression of mRNA was significantly higher than that in Val-Met group and Val, group Met (P0.01):Val-Met/Val, PepT2 mRNA expression in Met group was significantly higher than that in Val-Met group and Val Met group (P0.05); PHT1 mRNA expression of Leu-Met group was significantly higher than that in Leu-Met/Leu group (P0.05), Met, Leu-Met/Leu, K-, mRNA in Met group the expression of casein was significantly higher than that in Leu-Met group and Leu group (Met. P0.01, EIF-4E, mRNA) expression of Leu-Met group was significantly higher than that in Leu group, Met (P0.05).HPLC detection of BMEC cells before and after culture change, two peptide concentration of Met-Met/Met, Met and Leu-Met/Leu group, Met group of two peptides was higher than that in Met-Met group and Leu-Met.. Conclusion: (1) PepT1 Cloth in the cow MG interlobular connective tissue; PepT2 distribution in MG interlobar duct and acinar cavity inside epithelial cells. (2) PepT1 and PepT2 protein distributed in the cytoplasm. BMEC (3) PepT1 in the jejunum and duodenum of dairy cows, PepT2 in breast, PHT1 in spleen, thymus and cecum, PHT2 in lung volume. The highest expression of mRNA in cecum and thymus. (4) two peptides and amino acids in mixed culture can promote milk casein and K- protein synthesis related gene transcription: (5) Met, Val and Leu can promote the BMEC of Met-Met, Val-Met and Leu-Met two peptide transporters.

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：1661730