發(fā)布時間：2018-03-25 04:36

  本文選題：豬鏈球菌　切入點：精氨酸蛋白酶　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：豬鏈球菌是新生的重要的人畜共患病原菌,感染人類和豬后會出現(xiàn)敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等癥狀。至今為止,據(jù)有文獻(xiàn)記錄報道,豬鏈球菌已造成全球20多個國家超過1584例人類感染。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同,豬鏈球菌共計可分為33種血清型,而其中2型是臨床病例分離中最為常見的血清型,其次是14型,其他類型血清型如1型、4型、5型、16型和24型也均有報道。近年來雖然學(xué)術(shù)界對S.suis的感染關(guān)注度日益加大,然而對于豬鏈球菌致病機(jī)理,尤其是誘發(fā)腦膜炎以及中毒樣休克綜合征的潛在機(jī)制,知之甚少。鑒于病原菌蛋白酶在降解宿主組織、逃避和干擾宿主免疫系統(tǒng)等多方面的重要效能,在本研究中,我們重點關(guān)注豬鏈球菌精氨酸蛋白酶的鑒定工作,以及探討其在豬鏈球菌感染過程中所起的作用。淀粉酶結(jié)合蛋白B(Abpb)是本室早期鑒定到的重要的免疫原性蛋白,通過生物信息分析,顯示其假想的精氨酸蛋白酶功能。在本研究中,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),重組表達(dá)并純化了該目的蛋白。并利用明膠酶譜試驗確立了Abpb蛋白酶功能,和p NA偶聯(lián)的合成肽實驗確立了Abpb能高效分解精氨酸肽底物特性。另外重組表達(dá)的Abpb蛋白,能夠體外促進(jìn)RAW264.7分泌高水平炎性因子。對于Abpb蛋白的免疫原性驗證和研究,我們利用小鼠模型,腹腔免疫小鼠,ELISA檢測血清特異性抗體效價結(jié)果顯示Abpb能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度特異性抗體,在被動攻毒實驗中Abpb能給予小鼠很好的的免疫保護(hù)效果。對于Abpb基因表達(dá)定位,本研究通過了系列Western blot和流式實驗確認(rèn)了Abpb表達(dá)于豬鏈球菌細(xì)胞壁上以及少量分泌形式的表達(dá)。為了探討Abpb在豬鏈球菌2型感染中所起的作用,我們利用大腸桿菌和豬鏈球菌溫敏型穿梭載體p SET4s在SC19親本株下構(gòu)建了Abpb失活突變株△Abpb。在Balb/C小鼠腹腔感染模型上,突變株△Abpb相比較于野生菌株表現(xiàn)出明顯的毒力下降。由于豬鏈球菌早期的成功粘附和侵入表皮細(xì)胞和隨后的有效逃避和抵抗免疫細(xì)胞清除是豬鏈球菌成功感染的關(guān)鍵步驟,鑒于△Abpb下降的毒力,于是我們比較△Abpb突變株和野生菌株在粘附人喉表皮細(xì)胞Hep-2細(xì)胞能力的差異,結(jié)果顯示Abpb基因突變后,豬鏈球菌對Hep-2粘附能力下降明顯。與此同時,本研究分離了小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,在將突變株和野生菌株與其孵育時發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞能夠有效的將△Abpb突變株吞噬殺傷,效果為35%左右,然而對親本株幾乎檢測不到任何吞噬效果。為了進(jìn)一步驗證突變株△Abpb能夠更易清除,體內(nèi)共感染實驗被采取,在將等劑量的△Abpb突變株和野生菌株SC19混合后感染小鼠,并在不同時間點分別分離小鼠脾、肝、肺、腦以及血液中△Abpb突變株和親本株SC19含菌量的差異,結(jié)果顯示在感染過程中尤其是早期和晚期中,親本株SC19菌量明顯多于△Abpb突變株,在不同時間和器官中含量約為△Abpb突變株的2-8倍,這一結(jié)果同樣暗示著Abpb突變后豬鏈球菌削弱的感染能力以及更易清除。通過以上實驗,在此我們鑒定了豬鏈球菌2型細(xì)胞壁精氨酸蛋白酶,并發(fā)現(xiàn)該蛋白酶能夠降解宿主相關(guān)組織和促進(jìn)豬鏈球菌體內(nèi)克隆繁殖,并且與S.suis抵抗宿主巨噬細(xì)胞清除相關(guān),是豬鏈球菌新型的重要的毒力相關(guān)因子。另外,該蛋白能夠給予小鼠很好的免疫保護(hù)效果是理想的亞單位疫苗候選蛋白。
[Abstract]:Streptococcus suis is a new important zoonotic pathogens, human and swine infection occurs after septicemia, arthritis, endocarditis, meningitis and other symptoms. So far, according to records reported, Streptococcus suis has resulted in more than more than 20 countries around the world in 1584 cases of human infection. According to the capsular polysaccharide antigen is different, can be divided into a total of Streptococcus suis for the 33 serotypes, of which 2 is the most common type of serum clinical separation, followed by type 14, other types of serum type such as type 1, type 4, type 5, type 16 and type 24 were also reported in recent years. Although the academia of S.suis infection increasing attention however, the pathogenic mechanism of Streptococcus suis, especially induced meningitis and the potential mechanism of poisoning like shock syndrome, poorly understood. In view of the pathogen in the host tissue protease degradation, and avoid interference with the host immune system and so on important Efficiency, in this study, we focus on the identification of Streptococcus suis arginine protease, and explore its role in Streptococcus suis infection. Amylase binding protein B (Abpb) is the early identification to an immunogenic protein by bioinformatics analysis, the hypothetical arginine acid protease function. In this study, the E.coli Expression System, recombinant expression and purification of the target protein. Using zymography experiment established Abpb protease, peptide synthesis experiments and P coupled NA established Abpb can efficiently decompose arginine peptide substrate. In addition, recombinant Abpb protein, can in vitro RAW264.7 secreting high levels of inflammatory factors. The immunogenicity of Abpb protein and verification, we use the mouse model, intraperitoneal immunization of mice, ELISA detection of serum specific antibody titer results Abpb can stimulate mice to produce high titer of specific antibodies in the passive poison attack experiment Abpb mice can give good immune protection effect. The Abpb gene expression and localization, this study through a series of Western blot and flow cytometry experiments confirmed the expression of Abpb in Streptococcus suis cell walls and a few secretory expression in order to form. To investigate the effects of Abpb on Streptococcus suis type 2 infection in the role, we use the temperature sensitive Escherichia coli and Streptococcus suis shuttle vector p SET4s SC19 in the parental strain were constructed by inactivation of Abpb mutant in Abpb. delta model Balb/C mice infected with the mutant Abpb, compared to the wild strains showed significantly decreased virulence due to the success of the early adhesion of Streptococcus suis. And invasion of epidermal cells and effectively escape and subsequent immune cell clearance is a key step in the success of Streptococcus suis infection, in view of Abpb The decline of virulence, we compared differences between Abpb mutant and wild-type strain on the adhesion ability of Hep-2 cells in human laryngeal epithelial cells, the results showed that Abpb gene mutation, Hep-2 of Streptococcus suis adhesion ability decreased significantly. At the same time, the separation of the mouse peritoneal primary macrophages found in the mutant and wild strains were incubated with when macrophages could be Abpb mutant phagocytic rate is about 35%, however, the parent strain is almost not detected any phagocytic effect. In order to further verify the mutant Abpb can be more easily removed in vivo, CO infection experiment was taken, the dose of Abpb and mutant strains and wild strains of hybrid SC19 after the infection of mice, and at different time points were isolated from mouse spleen, liver, lung, brain and the differences in blood Abpb mutant and parent strains of SC19 bacteria, results in infection In the process of especially early and late, parental strains of SC19 were obviously higher than in the Abpb mutant, in different time and organs was about 2-8 times of the Abpb mutant strains, the results also imply that the Abpb mutant of Streptococcus suis infection ability weakened and easier to remove. By the experiment, we identification of Streptococcus suis type 2 cell wall arginine protease, and found that the protease can degrade host tissue and promote in vivo cloning and breeding of Streptococcus suis, S.suis resistance of host macrophages to clear, is the important model of Streptococcus suis virulence factors. In addition, the protein can give the mice immune protective effect of good subunit the ideal vaccine candidate protein.

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.611

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本文編號：1661603