本文選題：小反芻獸疫　切入點：N蛋白　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：小反芻獸疫(Peste des petits of ruminants)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)引起綿羊、山羊等的一種急性傳染病,臨床上以發(fā)熱、眼睛和鼻膿性分泌物、壞死性和糜爛性口腔炎、胃腸炎、腹瀉、呼吸困難、支氣管肺炎等為特征,發(fā)病率和死亡率極高,具有高度傳染性,被OIE列為A類疫病。該病1942年首次暴發(fā)于象牙海岸(即科特迪瓦),隨后蔓延至西非、中非、阿拉伯半島及南亞次大陸地區(qū),呈現(xiàn)由西向東蔓延的趨勢,甚至向歐洲傳播,給全球畜牧業(yè)經(jīng)濟帶來極大威脅。我國2007年7月在西藏自治區(qū)日土縣首次發(fā)現(xiàn)PPR疫情,此后在全國范圍內(nèi)普遍出現(xiàn)PPR疫情,疫情傳播快、跨度大、風(fēng)險高,給我國畜牧業(yè)造成嚴重損失,但疫情起源不明確。針對PPR,撲殺和疫苗接種是預(yù)防該病的主要手段,免疫效果的好壞是評價和控制疫情的一個重要指標。因此,通過建立一種PPRV間接ELISA抗體檢測方法,檢測抗體水平高低來評價免疫防控效果,達到免疫監(jiān)測的目的。小反芻獸疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)是一種不分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒,屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae),麻疹病毒屬(Morbolivirus)。PPRV基因組全長15948nt,編碼核蛋白(N)、血凝素蛋白(H)、磷蛋白(P)、融合蛋白(F)、基質(zhì)蛋白(M)和大多聚酶蛋白(L),及兩種非結(jié)構(gòu)蛋白C和V。其中N基因全長1578bp,具有高度保守性。麻疹病毒屬N蛋白序列相似性達67%-74%,N蛋白是病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的主要結(jié)構(gòu)蛋白;N蛋白在PPRV中是含量最高、免疫原性最強的蛋白,其抗原性穩(wěn)定;在PPRV感染的動物血清中針對N蛋白的抗體占很高成分,但不具有中和作用。同時,該蛋白還含有T細胞抗原表位,能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性細胞免疫反應(yīng)。因此,N蛋白是建立PPRV抗體檢測方法的理想候選抗原,可以利用N蛋白對羊群等動物群中PPRV抗體水平進行監(jiān)測,從而進行大范圍的免疫監(jiān)測。本研究擬以N蛋白作為包被抗原,通過建立檢測PPRV抗體的間接ELISA方法,為研制PPR免疫抗體監(jiān)測試劑盒奠定基礎(chǔ)。研究首先采用人工合成PPRV N蛋白基因序列構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSumo-mut-N,經(jīng)EcoR I/Xho I雙酶切和測序證明構(gòu)建成功后,將重組質(zhì)粒pSumo-mut-N轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express中,獲得表達菌N-Arctic Express。經(jīng)條件優(yōu)化,確定N蛋白最優(yōu)表達條件為在0.5mM IPTG誘導(dǎo),11℃時震蕩培養(yǎng)10h。N蛋白表達量為120μg/ml。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析顯示,重組蛋白相對分子質(zhì)量約71.9kDa,與PRRV羊陽性血清具有良好的反應(yīng)原性。采用Ni柱親和層析對表達的N蛋白進行純化,以該純化的N蛋白為包被抗原,以已知PRRV羊陰、陽性血清進行檢測條件的優(yōu)化,建立了PPRV間接ELISA抗體檢測方法。確定間接ELISA建立的程序為:(1)抗原包被:酶聯(lián)板抗原包被量0.24ug/孔,100μl/孔,37℃包被2h;(2)封閉:加入5%脫脂奶粉于37℃封閉1.5h,200μl/孔;(3)與待檢血清樣品反應(yīng):加入用PBST作1:40倍稀釋的血清,100μl/孔,37℃孵育50min;(4)與二抗反應(yīng):加入1:5000倍稀釋的HRP標記的兔抗羊Ig G,100μl/孔,37℃孵育1h;(5)顯色:加入TMB,100μl/孔,37℃避光顯色15min;(6)終止:加入2M H2SO4終止反應(yīng),50μl/孔,酶標儀讀取OD450值。通過中和試驗確定屠宰場采集的15份羊血清、免疫PPRV細胞毒的兩只健康羊采集血清的陰、陽性。根據(jù)上述確定的間接ELISA最佳程序?qū)ν涝讏霾杉?5份已知陰、陽性羊血清、免疫PPRV細胞毒的兩只健康羊采集血清、某地患病羊群采集的11份血清、開封疾控中心采集饋贈的31份臨床樣品血清(為已知血清,經(jīng)競爭ELISA檢測為全陰性)進行檢測。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法計算陰性血清OD450的平均值X=0.470,標準差SD=0.16594,根據(jù)公式X±3SD計算血清樣品陰、陽性臨界值及其判定標準。經(jīng)計算X±3SD=0.968,確定待檢血清OD450值≥0.968為陽性,待檢血清OD450值㩳0.968為陰性。對上述羊血清樣品利用ROC曲線評估此間接ELISA方法,其ROC曲線的AUC=1,說明此間接ELISA方法應(yīng)用價值較高,且其敏感性和特異性均為100%。同時,批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果均表明此方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。針對上述31份臨床樣品血清的間接ELISA檢測結(jié)果與血清提供單位的競爭ELISA檢測結(jié)果完全一致,均為陰性,符合率為100%。綜上,本研究成功構(gòu)建了PPRV N蛋白原核表達重組菌,誘導(dǎo)表達了N蛋白;利用該蛋白確定了PPRV間接ELISA抗體檢測方法的最佳程序。對臨床血清樣品的檢測結(jié)果顯示,其ROC曲線的AUC=1,說明其應(yīng)用價值較高,為PPRV間接ELISA抗體檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S855.3

【參考文獻】

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1 楊香芳;竇永喜;王秋霞;駱學(xué)農(nóng);曾巧英;朱啟運;才學(xué)鵬;;小反芻獸疫病毒F基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2013年05期

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本文編號：1646913