本文選題：小反芻獸疫　切入點(diǎn)：N蛋白　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：小反芻獸疫(Peste des petits of ruminants)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)引起綿羊、山羊等的一種急性傳染病,臨床上以發(fā)熱、眼睛和鼻膿性分泌物、壞死性和糜爛性口腔炎、胃腸炎、腹瀉、呼吸困難、支氣管肺炎等為特征,發(fā)病率和死亡率極高,具有高度傳染性,被OIE列為A類(lèi)疫病。該病1942年首次暴發(fā)于象牙海岸(即科特迪瓦),隨后蔓延至西非、中非、阿拉伯半島及南亞次大陸地區(qū),呈現(xiàn)由西向東蔓延的趨勢(shì),甚至向歐洲傳播,給全球畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)極大威脅。我國(guó)2007年7月在西藏自治區(qū)日土縣首次發(fā)現(xiàn)PPR疫情,此后在全國(guó)范圍內(nèi)普遍出現(xiàn)PPR疫情,疫情傳播快、跨度大、風(fēng)險(xiǎn)高,給我國(guó)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失,但疫情起源不明確。針對(duì)PPR,撲殺和疫苗接種是預(yù)防該病的主要手段,免疫效果的好壞是評(píng)價(jià)和控制疫情的一個(gè)重要指標(biāo)。因此,通過(guò)建立一種PPRV間接ELISA抗體檢測(cè)方法,檢測(cè)抗體水平高低來(lái)評(píng)價(jià)免疫防控效果,達(dá)到免疫監(jiān)測(cè)的目的。小反芻獸疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)是一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒,屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae),麻疹病毒屬(Morbolivirus)。PPRV基因組全長(zhǎng)15948nt,編碼核蛋白(N)、血凝素蛋白(H)、磷蛋白(P)、融合蛋白(F)、基質(zhì)蛋白(M)和大多聚酶蛋白(L),及兩種非結(jié)構(gòu)蛋白C和V。其中N基因全長(zhǎng)1578bp,具有高度保守性。麻疹病毒屬N蛋白序列相似性達(dá)67%-74%,N蛋白是病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的主要結(jié)構(gòu)蛋白;N蛋白在PPRV中是含量最高、免疫原性最強(qiáng)的蛋白,其抗原性穩(wěn)定;在PPRV感染的動(dòng)物血清中針對(duì)N蛋白的抗體占很高成分,但不具有中和作用。同時(shí),該蛋白還含有T細(xì)胞抗原表位,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此,N蛋白是建立PPRV抗體檢測(cè)方法的理想候選抗原,可以利用N蛋白對(duì)羊群等動(dòng)物群中PPRV抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè),從而進(jìn)行大范圍的免疫監(jiān)測(cè)。本研究擬以N蛋白作為包被抗原,通過(guò)建立檢測(cè)PPRV抗體的間接ELISA方法,為研制PPR免疫抗體監(jiān)測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。研究首先采用人工合成PPRV N蛋白基因序列構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSumo-mut-N,經(jīng)EcoR I/Xho I雙酶切和測(cè)序證明構(gòu)建成功后,將重組質(zhì)粒pSumo-mut-N轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express中,獲得表達(dá)菌N-Arctic Express。經(jīng)條件優(yōu)化,確定N蛋白最優(yōu)表達(dá)條件為在0.5mM IPTG誘導(dǎo),11℃時(shí)震蕩培養(yǎng)10h。N蛋白表達(dá)量為120μg/ml。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析顯示,重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約71.9kDa,與PRRV羊陽(yáng)性血清具有良好的反應(yīng)原性。采用Ni柱親和層析對(duì)表達(dá)的N蛋白進(jìn)行純化,以該純化的N蛋白為包被抗原,以已知PRRV羊陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)條件的優(yōu)化,建立了PPRV間接ELISA抗體檢測(cè)方法。確定間接ELISA建立的程序?yàn)?(1)抗原包被:酶聯(lián)板抗原包被量0.24ug/孔,100μl/孔,37℃包被2h;(2)封閉:加入5%脫脂奶粉于37℃封閉1.5h,200μl/孔;(3)與待檢血清樣品反應(yīng):加入用PBST作1:40倍稀釋的血清,100μl/孔,37℃孵育50min;(4)與二抗反應(yīng):加入1:5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊Ig G,100μl/孔,37℃孵育1h;(5)顯色:加入TMB,100μl/孔,37℃避光顯色15min;(6)終止:加入2M H2SO4終止反應(yīng),50μl/孔,酶標(biāo)儀讀取OD450值。通過(guò)中和試驗(yàn)確定屠宰場(chǎng)采集的15份羊血清、免疫PPRV細(xì)胞毒的兩只健康羊采集血清的陰、陽(yáng)性。根據(jù)上述確定的間接ELISA最佳程序?qū)ν涝讏?chǎng)采集的15份已知陰、陽(yáng)性羊血清、免疫PPRV細(xì)胞毒的兩只健康羊采集血清、某地患病羊群采集的11份血清、開(kāi)封疾控中心采集饋贈(zèng)的31份臨床樣品血清(為已知血清,經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)為全陰性)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算陰性血清OD450的平均值X=0.470,標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.16594,根據(jù)公式X±3SD計(jì)算血清樣品陰、陽(yáng)性臨界值及其判定標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)計(jì)算X±3SD=0.968,確定待檢血清OD450值≥0.968為陽(yáng)性,待檢血清OD450值㩳0.968為陰性。對(duì)上述羊血清樣品利用ROC曲線(xiàn)評(píng)估此間接ELISA方法,其ROC曲線(xiàn)的AUC=1,說(shuō)明此間接ELISA方法應(yīng)用價(jià)值較高,且其敏感性和特異性均為100%。同時(shí),批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果均表明此方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。針對(duì)上述31份臨床樣品血清的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果與血清提供單位的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果完全一致,均為陰性,符合率為100%。綜上,本研究成功構(gòu)建了PPRV N蛋白原核表達(dá)重組菌,誘導(dǎo)表達(dá)了N蛋白;利用該蛋白確定了PPRV間接ELISA抗體檢測(cè)方法的最佳程序。對(duì)臨床血清樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示,其ROC曲線(xiàn)的AUC=1,說(shuō)明其應(yīng)用價(jià)值較高,為PPRV間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊香芳;竇永喜;王秋霞;駱學(xué)農(nóng);曾巧英;朱啟運(yùn);才學(xué)鵬;;小反芻獸疫病毒F基因核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2013年05期

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本文編號(hào)：1646913