本文選題：牛　切入點(diǎn)：多殺性巴氏桿菌　出處：《西南大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：多殺性巴氏桿菌{Pasteurella multocida, Pm)是造成牛出血性敗血病,羊敗血病或肺炎,鳥(niǎo)類(lèi)禽霍亂,豬萎縮性鼻炎,兔膿血癥等多種動(dòng)物疾病的原因,給世界各地的畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,預(yù)防和控制巴氏桿菌病的疫苗有弱毒苗和滅活苗,但由于巴氏桿菌血清型較多,不同菌株間缺乏相應(yīng)的交叉保護(hù),且疫苗保護(hù)期較短等原因,該病仍未得到有效的控制。2008年以來(lái),我國(guó)一些省份相繼檢測(cè)出牛源A型多殺性巴氏桿菌,它主要引起牛肺炎。由于現(xiàn)有疫苗株均為B型巴氏桿菌,還沒(méi)有針對(duì)A型多殺性巴氏桿菌的疫苗,因此,人們希望研究出一種能對(duì)多種巴氏桿菌血清型菌株提供交叉保護(hù)且有安全保證的新型疫苗。伴隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,人們對(duì)疫苗的研究進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)期。現(xiàn)在,已經(jīng)越來(lái)越多的病原微生物完成了全基因組序列的測(cè)序,這就為利用反向疫苗學(xué)研發(fā)各種新型疫苗提供了數(shù)據(jù)平臺(tái)。以研究基因組序列為基礎(chǔ)的“反向疫苗學(xué)”已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用到新型疫苗的研發(fā)中,逐漸成為一條新的疫苗研制途徑。反向疫苗學(xué)通過(guò)對(duì)病原生物的基因組序列分析,預(yù)測(cè)出潛在的具有免疫原性的候選抗原,不必進(jìn)行大量病原微生物培養(yǎng),即可通過(guò)高通量表達(dá),利用蛋白免疫印跡或間接ELISA等免疫學(xué)方法分析、篩選和鑒定出特異性抗原,并在小鼠模型中檢測(cè)候選抗原的免疫保護(hù)性,從而篩選出具有保護(hù)性的抗原,作為疫苗的免疫抗原,為研制有效的疫苗提供理論依據(jù)。這不僅提高了候選疫苗的篩選成功率,同時(shí)還有助于預(yù)測(cè)和發(fā)現(xiàn)以往所不知的各種免疫原,具有十分重要和深遠(yuǎn)的意義。按照反向疫苗學(xué)的思路,本研究所做的具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：1、牛源A型多殺性巴氏桿菌保護(hù)性抗原的初步篩選及克隆表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)完成對(duì)牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株的全基因組測(cè)序和分析,預(yù)測(cè)其編碼的基因并注釋編碼的功能蛋白,構(gòu)建了PmCQ2株全基因組序列本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。本研究就是利用反向疫苗學(xué)的思想,應(yīng)用生物信息學(xué)方法,如在線分析工具SignalR-3.0 server、SMART、TMHMM Server v.2.0對(duì)PmCQ2的部分蛋白進(jìn)行分析,篩選出具有信號(hào)肽或跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白作為保護(hù)性抗原候選分子,最終篩選出56個(gè)保護(hù)性抗原候選基因。將抗原候選基因分別設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)PCR克隆,進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后,與同樣進(jìn)行雙酶切反應(yīng)的原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接構(gòu)建重組載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析,56個(gè)重組目標(biāo)蛋白均成功在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。2、牛源巴氏桿菌保護(hù)性抗原候選分子的間接ELISA方法篩選將56個(gè)重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)后,收集菌體,用Ni柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)完成了對(duì)牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2株的36個(gè)推定蛋白克隆表達(dá)和純化,將這92個(gè)純化后蛋白經(jīng)透析復(fù)性后包被酶聯(lián)板,利用4種牛血清：A型人工感染血清、A型滅活苗免疫血清、B型人工感染血清和F型人工感染血清,按照間接ELISA方法來(lái)篩選具有良好反應(yīng)原性的蛋白。最終篩選出只能與A型血清反應(yīng)而不與B、F型血清反應(yīng)的PmA型特異蛋白2個(gè)；只與A型人工感染血清反應(yīng),不與A型滅活苗血清反應(yīng)的PmA型差異蛋白13個(gè)；均能與A型、B型和F型反應(yīng)的共有蛋白20個(gè)。3、部分保護(hù)性抗原候選分子對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性研究為了驗(yàn)證所篩選部分蛋白對(duì)免疫動(dòng)物的保護(hù)力,本研究以小鼠為模型,將PmA型、PmB型和PmF型共有蛋白2個(gè)(1,L17)和PmA型差異蛋白2個(gè)(11,L16)用弗氏佐劑乳化后,分別皮下免疫小鼠。檢驗(yàn)四種蛋白對(duì)A型巴氏桿菌的保護(hù)力時(shí),免疫劑量設(shè)置兩個(gè)梯度,實(shí)驗(yàn)組1每只小鼠免疫50gg,實(shí)驗(yàn)組2每只小鼠免疫75μg,三免后第10天以3LD50劑量攻毒牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2株,結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種蛋白對(duì)PmCQ2株抵抗力都很高,可達(dá)50%以上；75μg高免疫劑量與50μg低免疫劑量相比,11號(hào)蛋白的免疫保護(hù)率明顯提高,由原來(lái)的70%上升到90%。檢驗(yàn)四種蛋白對(duì)B型和F型巴氏桿菌保護(hù)性時(shí),每只小鼠免疫劑量均為75μg,三免后分別3LD5o劑量攻毒B型和F型巴氏桿菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn),1號(hào),11號(hào),L17號(hào)蛋白對(duì)B型均有較高的保護(hù)性,但對(duì)F型巴氏桿菌保護(hù)性較低。而L16號(hào)蛋白對(duì)B型、F型的免疫保護(hù)性均較低,這個(gè)結(jié)果也與間接ELISA實(shí)驗(yàn)相吻合。綜上所述,本研究利用反向疫苗學(xué)所篩選了92個(gè)保護(hù)性抗原候選分子,并經(jīng)間接ELISA篩選后,在小鼠模型中驗(yàn)證其免疫保護(hù)力,結(jié)果證實(shí),蛋白1號(hào),11號(hào),L17號(hào)三種蛋白在小鼠模型中,能夠提供對(duì)A型、B型巴氏桿菌較高的交叉保護(hù)性,提示可以作為牛源多殺性巴氏桿菌有效的疫苗,為多殺性巴氏桿菌亞單位疫苗提供靶標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S855.12

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1637316