本文選題：星狀病毒　切入點(diǎn)：RT-PCR　出處：《江西農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：星狀病毒(Astrovirus)被認(rèn)為是引起嬰幼兒、老年人及抵抗力缺陷人群病毒性腹瀉的第二大病原。星狀病毒廣泛分布于世界各地,可感染人、多種哺乳動(dòng)物和禽類,其基因組變異性較大,適應(yīng)宿主能力強(qiáng)。有研究表明星狀病毒存在不同血清型和不同種間的基因重組,并可能存在動(dòng)物之間和動(dòng)物與人之間的跨種傳播。星狀病毒的宿主適應(yīng)性、衣殼蛋白變異性、基因重組性使得其具有潛在的公共衛(wèi)生學(xué)危險(xiǎn)。豬星狀病毒(Porcine Astrovirus,PAst V)可與輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒等腸道病原混合感染引起仔豬腹瀉,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究根據(jù)Gen Bank登錄的PAst VRNA依賴型RNA多聚酶(RDRP)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,建立并優(yōu)化了一種快速高效的反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR),將擴(kuò)增出的片段命名為H片段。然后,將H片段克隆至p MD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用于敏感性檢測(cè)。敏感性檢測(cè)結(jié)果表明本研究建立的RT-PCR方法能檢測(cè)到的最低模板拷貝濃度為103copies/μl。應(yīng)用該檢測(cè)方法對(duì)從江西地區(qū)10個(gè)商業(yè)豬場(chǎng)采集的共219份仔豬糞便和腸組織樣品進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表明PAst V在糞便樣品的陽(yáng)性率為29.2%(47/161),在腸組織樣品的陽(yáng)性率為51.7%(30/58)。從樣品采集時(shí)間來(lái)看,1月份的樣品陽(yáng)性率最高為66.7%,3月份最低為18.7%。為研究江西地區(qū)豬星狀病毒的遺傳變異和分子流行病學(xué),本研究首先對(duì)Gen Bank目前登錄的12條PAst V全長(zhǎng)序列進(jìn)行了比對(duì)分析,在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物,對(duì)兩株分別采集自江西吉安和江西樟樹(shù)的PAst VJXJA株和JXZS株的基因組進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增,另外設(shè)計(jì)了2條RACE引物對(duì)c NDA末端進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增的片段連接至p MD18-T載體并克隆測(cè)序。使用DNASTAR的Editseq和Mega Align等軟件將得到的各片段序列進(jìn)行編輯和裝配,最終得到JXJA株全長(zhǎng)為6675nt,JXZS株全長(zhǎng)為6700nt。對(duì)這兩株病毒基因進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)這兩株病毒全基因核苷酸和氨基酸同源性分別為82.2%和66.3%,ORF1a同源性分別為94.9%和97.6%,ORF2同源性分別為62.6%和49.9%。本研究使用MEGA 6.0軟件對(duì)JXJA株、JXZS株和Gen Bank上登錄的其它30株哺乳動(dòng)物和禽類星狀病毒參考株的全基因序列做遺傳進(jìn)化分析,對(duì)JXJA株、JXZS株和其他11株P(guān)Ast V的全基因、ORF1a基因、ORF2基因分別做了遺傳進(jìn)化分析。全基因組進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明豬星狀病毒JXJA株和JXZS株與豬星狀病毒4型遺傳距離最近,與鼠星狀病毒較近,存在重組的可能,與人星狀病毒較遠(yuǎn),重組可能性較低。此外,ORF2的進(jìn)化結(jié)果表明,JXZS株與JXJA株以及其他2株4型PAst V包括野豬星狀病毒匈牙利株處于進(jìn)化樹(shù)不同分支,基于星狀病毒依據(jù)ORF2基因型分型的原則,JXZS株可能為一株新型的豬星狀病毒。本研究建立了一種針對(duì)PAst V的RT-PCR檢測(cè)方法,將該方法用于江西商業(yè)豬場(chǎng)的PAst V感染率檢測(cè),結(jié)果表明江西地區(qū)豬群PAst V感染普遍,冬季較高。與此同時(shí),本研究對(duì)兩株江西地區(qū)PAst V的全基因序列進(jìn)行了分析,分析結(jié)果揭示了江西地區(qū)PAst V的遺傳和變異關(guān)系,本研究的測(cè)序株與目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的僅有的1株上海株和1株廣西株基因組差異大,提示與這兩株P(guān)Ast V可能屬于不同的血清型。研究結(jié)果為PAst V的研究提供了更多的參考依據(jù),為PAst V的診斷和防控提供了理論基礎(chǔ)和方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1637243