本文選題：星狀病毒　切入點：RT-PCR　出處：《江西農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：星狀病毒(Astrovirus)被認為是引起嬰幼兒、老年人及抵抗力缺陷人群病毒性腹瀉的第二大病原。星狀病毒廣泛分布于世界各地,可感染人、多種哺乳動物和禽類,其基因組變異性較大,適應宿主能力強。有研究表明星狀病毒存在不同血清型和不同種間的基因重組,并可能存在動物之間和動物與人之間的跨種傳播。星狀病毒的宿主適應性、衣殼蛋白變異性、基因重組性使得其具有潛在的公共衛(wèi)生學危險。豬星狀病毒(Porcine Astrovirus,PAst V)可與輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒等腸道病原混合感染引起仔豬腹瀉,造成巨大的經(jīng)濟損失。本研究根據(jù)Gen Bank登錄的PAst VRNA依賴型RNA多聚酶(RDRP)基因的保守區(qū)域設(shè)計引物,建立并優(yōu)化了一種快速高效的反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應檢測方法(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR),將擴增出的片段命名為H片段。然后,將H片段克隆至p MD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒標準品用于敏感性檢測。敏感性檢測結(jié)果表明本研究建立的RT-PCR方法能檢測到的最低模板拷貝濃度為103copies/μl。應用該檢測方法對從江西地區(qū)10個商業(yè)豬場采集的共219份仔豬糞便和腸組織樣品進行了檢測,檢測結(jié)果表明PAst V在糞便樣品的陽性率為29.2%(47/161),在腸組織樣品的陽性率為51.7%(30/58)。從樣品采集時間來看,1月份的樣品陽性率最高為66.7%,3月份最低為18.7%。為研究江西地區(qū)豬星狀病毒的遺傳變異和分子流行病學,本研究首先對Gen Bank目前登錄的12條PAst V全長序列進行了比對分析,在此基礎(chǔ)上設(shè)計了5對特異性引物,對兩株分別采集自江西吉安和江西樟樹的PAst VJXJA株和JXZS株的基因組進行全長擴增,另外設(shè)計了2條RACE引物對c NDA末端進行擴增,將擴增的片段連接至p MD18-T載體并克隆測序。使用DNASTAR的Editseq和Mega Align等軟件將得到的各片段序列進行編輯和裝配,最終得到JXJA株全長為6675nt,JXZS株全長為6700nt。對這兩株病毒基因進行同源性分析,發(fā)現(xiàn)這兩株病毒全基因核苷酸和氨基酸同源性分別為82.2%和66.3%,ORF1a同源性分別為94.9%和97.6%,ORF2同源性分別為62.6%和49.9%。本研究使用MEGA 6.0軟件對JXJA株、JXZS株和Gen Bank上登錄的其它30株哺乳動物和禽類星狀病毒參考株的全基因序列做遺傳進化分析,對JXJA株、JXZS株和其他11株P(guān)Ast V的全基因、ORF1a基因、ORF2基因分別做了遺傳進化分析。全基因組進化樹分析結(jié)果表明豬星狀病毒JXJA株和JXZS株與豬星狀病毒4型遺傳距離最近,與鼠星狀病毒較近,存在重組的可能,與人星狀病毒較遠,重組可能性較低。此外,ORF2的進化結(jié)果表明,JXZS株與JXJA株以及其他2株4型PAst V包括野豬星狀病毒匈牙利株處于進化樹不同分支,基于星狀病毒依據(jù)ORF2基因型分型的原則,JXZS株可能為一株新型的豬星狀病毒。本研究建立了一種針對PAst V的RT-PCR檢測方法,將該方法用于江西商業(yè)豬場的PAst V感染率檢測,結(jié)果表明江西地區(qū)豬群PAst V感染普遍,冬季較高。與此同時,本研究對兩株江西地區(qū)PAst V的全基因序列進行了分析,分析結(jié)果揭示了江西地區(qū)PAst V的遺傳和變異關(guān)系,本研究的測序株與目前國內(nèi)報道的僅有的1株上海株和1株廣西株基因組差異大,提示與這兩株P(guān)Ast V可能屬于不同的血清型。研究結(jié)果為PAst V的研究提供了更多的參考依據(jù),為PAst V的診斷和防控提供了理論基礎(chǔ)和方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：1637243