本文選題：牛　切入點(diǎn)：長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肌肉和脂肪組織是牛肉的主要組成部分,為此,發(fā)掘調(diào)控牛肌肉與脂肪生成的關(guān)鍵基因,對(duì)提高牛肉品質(zhì)和肉牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀具有重要意義。目前已知大量編碼蛋白的基因?qū)∪馀c脂肪的發(fā)育具有重要調(diào)控作用,例如:調(diào)控肌肉發(fā)育關(guān)鍵基因Myo D和My HC,調(diào)控脂肪生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ,以及同時(shí)對(duì)肌肉和脂肪的發(fā)育具有調(diào)控作用的Sirt1和Klf5等。近年來,越來越多的具有調(diào)控功能的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lnc RNA)被揭示,但大多數(shù)與肌肉、脂肪發(fā)育相關(guān)的研究只是利用測(cè)序的方法揭示一些候選lnc RNAs,對(duì)候選lnc RNAs功能的研究相對(duì)較少。因此,本研究以牛為研究對(duì)象,從實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序結(jié)果中篩選出候選lnc RNA,并利用RACE、生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和q RT-PCR等現(xiàn)代生物技術(shù),對(duì)肌肉與脂肪發(fā)育相關(guān)lnc RNA lnc FAM200B進(jìn)行鑒定、啟動(dòng)子活性及遺傳變異研究,以期為深入探討lnc RNA的功能與作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),為提高牛肉品質(zhì)與生長(zhǎng)發(fā)育性狀等提供科學(xué)資料。1.牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA lnc FAM200B的全長(zhǎng)克隆、鑒定與表達(dá)規(guī)律研究本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,新lnc RNA lnc FAM200B在秦川牛胎牛、犢牛、成年牛肌肉組織中差異表達(dá)。本試驗(yàn)利用RACE對(duì)lnc FAM200B的序列特征進(jìn)行研究,獲得了lnc FAM200B共472 bp的全長(zhǎng)序列;原核表達(dá)分析顯示lnc FAM200B不具備蛋白編碼的能力;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:lnc FAM200B啟動(dòng)子區(qū)3000 bp序列中包含30個(gè)C/EBPα和7個(gè)CEBPβ等與脂肪細(xì)胞生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),43個(gè)SP1轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位點(diǎn),其中,SP1富集區(qū)域易與肌肉發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Myo D結(jié)合。lnc FAM200B在肌肉和脂肪中的表達(dá)分析顯示lnc FAM200B在秦川牛犢牛肌肉中的表達(dá)水平顯著低于在胎牛、成年牛肌肉中的表達(dá)水平。與此同時(shí),在犢牛、成年牛脂肪中的表達(dá)水平均高于在同一時(shí)期肌肉中的表達(dá)水平。這些研究結(jié)果表明lnc FAM200B可能影響牛肌肉與脂肪發(fā)育。2.牛長(zhǎng)鏈非編碼RNAlncFAM200B基因啟動(dòng)子活性研究生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牛lnc FAM200B基因可能與脂肪與肌肉發(fā)育相關(guān),因此,本研究利用人胚腎293T、小鼠成肌細(xì)胞C2C12和前脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞系,通過構(gòu)建并轉(zhuǎn)染包含lnc FAM200B啟動(dòng)子不同截短體的p GL3-Basic重組質(zhì)粒并檢測(cè)雙熒光素酶活性,進(jìn)一步分析lnc FAM200B基因啟動(dòng)子區(qū)的活性區(qū)域。結(jié)果顯示,在293T、C2C12、3T3-L1三種細(xì)胞系中,不同截短體對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)是一致的,從p GL3-pro4(-403)縮短到p GL3-pro5(-139)的過程中,熒光活性出現(xiàn)了極顯著的降低(P0.01),提示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前-403至-139 bp之間為啟動(dòng)子活性區(qū)域。對(duì)不同細(xì)胞系中的熒光活性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),不同截短體在三種細(xì)胞系中的活性依次為293TC2C123T3-L1(P0.01)。lnc FAM200B的啟動(dòng)子活性在3T3-L1細(xì)胞中最強(qiáng),其次是在C2C12細(xì)胞中,與lnc FAM200B在肌肉、脂肪中的表達(dá)水平一致。對(duì)啟動(dòng)子活性區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),264 bp的活性區(qū)域中有6個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SP1潛在的結(jié)合位點(diǎn),2個(gè)與脂肪發(fā)育密切相關(guān)的C/EBPα潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果提示lnc FAM200B可能對(duì)牛肌肉和脂肪的發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。3.牛長(zhǎng)鏈非編碼RNAlnc FAM200B基因遺傳變異及其遺傳效應(yīng)研究肌肉和脂肪的發(fā)育是影響個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的主要原因,因此,本研究進(jìn)一步從群體水平上分析lnc FAM200B基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與牛生長(zhǎng)相關(guān)性狀的關(guān)系。DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)南陽牛lnc FAM200B基因第1內(nèi)含子存在1個(gè)SNP突變(AC_000163:g.2472 TC,Taq I);利用PCR-RFLP方法鑒定145頭南陽牛個(gè)體的基因型,結(jié)果顯示:TC基因型的頻率最高(0.57),CC基因型的頻率最低(0.02)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,該遺傳變異位點(diǎn)不同基因型與6月齡南陽牛的體重、體高、體斜長(zhǎng)、日增重等4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育性狀顯著相關(guān)(P0.05),與12月齡的體高和體斜長(zhǎng)顯著相關(guān)(P0.05)。該結(jié)果為進(jìn)一步研究lnc FAM200B基因在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能奠定了基礎(chǔ),并為提高牛肉品質(zhì)與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種提供基礎(chǔ)材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：1634227