本文選題：狂犬病病毒　切入點(diǎn)：磷蛋白　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：狂犬病病毒(rabies virus,RABV)屬于單負(fù)病毒目(Mononegavirals)彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)成員,感染機(jī)體后引起一種以腦脊髓炎為主要臨床癥狀的致死率極高的神經(jīng)性疾病(狂犬病)。該病毒感染包括人類在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動(dòng)物,一旦出現(xiàn)臨床神經(jīng)癥狀,致死率達(dá)100%。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,對(duì)RABV致病機(jī)理的深入研究發(fā)現(xiàn),構(gòu)成該病毒基因組的結(jié)構(gòu)蛋白成分在病毒感染、復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用,其中RABV磷蛋白(phosphoprotein,P)可與宿主細(xì)胞一些蛋白成分相互作用形成復(fù)合物,揭示了P蛋白可在宿主與病毒相互作用過(guò)程中發(fā)揮多種功能。例如能夠阻止干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory fator,IRF3)的激活,從而阻止干擾素α/β的表達(dá),進(jìn)而逃逸宿主細(xì)胞的固有免疫。我們前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在細(xì)胞水平上證實(shí)了RABV強(qiáng)毒株BD06株和弱毒株SRV9株P(guān)蛋白對(duì)RIG-I依賴的干擾素通路均有一定的抑制作用,而P蛋白在體內(nèi)對(duì)RIG-I依賴的干擾素通路是否有抑制作用,需要將P蛋白基因?qū)塍w內(nèi)進(jìn)行研究。對(duì)P蛋白功能的研究需基于該蛋白的獨(dú)立表達(dá),以避免RABV其他結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)對(duì)其功能的影響。P蛋白的獨(dú)立表達(dá)需要一種有效的真核表達(dá)載體介導(dǎo)。腺病毒載體作為一種常用的真核表達(dá)載體,其基因組大小適中,具有一定的外源基因承載能力,可介導(dǎo)外源基因高效表達(dá),制備高滴度病毒容易,表達(dá)的重組靶蛋白接近天然蛋白的生物學(xué)功能,且具有良好的生物活性,因此是闡明蛋白功能的有力工具�；谝陨峡紤],本研究擬選用復(fù)制缺陷型人5型腺病毒表達(dá)系統(tǒng),分別構(gòu)建RABV強(qiáng)毒株(BD06株)與弱毒株(SRV9株)P蛋白的重組人5型腺病毒,為進(jìn)一步比較強(qiáng)弱毒株P(guān)蛋白對(duì)機(jī)體固有免疫的影響。我們分別將狂犬病病毒強(qiáng)毒株(BD06株)與弱毒株(SRV9株)完整的P蛋白基因編碼區(qū)克隆入腺病毒表達(dá)系統(tǒng)穿梭質(zhì)粒,獲得重組穿梭質(zhì)粒pacAd5-BD06-P和pacAd5-SRV9-P。重組穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒被限制性內(nèi)切酶PacI線性化后,共轉(zhuǎn)染HEK293AD細(xì)胞,經(jīng)同源重組并包裝出攜帶RABV-P基因的重組腺病毒rAd5-BD06-P和rAd5-SRV9-P。待病毒增殖穩(wěn)定后,從病毒培養(yǎng)液上清中PCR擴(kuò)增得到894bp大小的目的條帶,證明目的基因P蛋白已重組到腺病毒基因組中;取重組病毒培養(yǎng)物經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染,于透射電鏡下可觀察到腺病毒粒子的典型特征。利用P蛋白基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物對(duì)重組腺病毒感染的HEK293AD細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增均得到了894bp大小的目的條帶,證實(shí)P蛋白基因可被腺病毒介導(dǎo)在HEK293AD細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄;以FITC標(biāo)記的抗P蛋白單克隆抗體對(duì)2株重組腺病毒感染的復(fù)制型細(xì)胞系和非復(fù)制型細(xì)胞系進(jìn)行直接免疫熒光檢測(cè),熒光顯微鏡下均可見(jiàn)特異性熒光,結(jié)果表明P蛋白可在復(fù)制型細(xì)胞系和非復(fù)制型細(xì)胞系中表達(dá);以抗P蛋白的單克隆抗體對(duì)2株重組腺病毒感染的HEK293AD細(xì)胞中的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè),結(jié)果顯示均出現(xiàn)了約40kDa的特異性條帶,這也從蛋白水平上證實(shí)了P蛋白在感染細(xì)胞中表達(dá)。增殖穩(wěn)定的重組腺病毒滴度均可達(dá)107.5TCID50/ml以上,且一步增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示外源基因的插入對(duì)病毒的增殖影響不明顯。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)P蛋白基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)特性,將2×106.5TCID50的重組腺病毒rAd5-BD06-P和rAd5-SRV9-P腹腔接種小鼠(每組4只),分別于接種前及接種14d后尾靜脈采血,分離血清,300~500倍稀釋作為待檢樣品,RABV作為抗原,利用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)接種重組病毒后的小鼠血清中是否存在針對(duì)RABV P蛋白抗體及反應(yīng)活性。結(jié)果顯示,重組腺病毒rAd5-BD06-P和rAd5-SRV9-P能有效感染小鼠,介導(dǎo)P基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá),并能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)RABV P蛋白抗體,且與RABV有良好的反應(yīng)活性。綜上所述,本研究成功構(gòu)建了表達(dá)狂犬病病毒BD06株和SRV9株P(guān)蛋白復(fù)制缺陷型重組人5型腺病毒,重組腺病毒表達(dá)的P蛋白在感染細(xì)胞和小鼠體內(nèi)均呈現(xiàn)良好的抗原反應(yīng)性和免疫原性,為進(jìn)一步研究P蛋白在病毒感染過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 王穎;張守峰;劉曄;張菲;張錦霞;扈榮良;;狂犬病病毒糖蛋白重組人腺病毒的構(gòu)建及免疫效果的初步研究[J];病毒學(xué)報(bào);2011年05期

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本文編號(hào)：1632032