本文選題：HSP　切入點(diǎn)：天祝白牦牛　出處：《核農(nóng)學(xué)報(bào)》2017年08期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：HSP60對(duì)動(dòng)物的睪丸發(fā)育、精子發(fā)生起著重要的調(diào)控作用。支持細(xì)胞是睪丸內(nèi)唯一與生精細(xì)胞直接發(fā)生聯(lián)系的體細(xì)胞,對(duì)精子發(fā)生、成熟等過(guò)程有直接影響。為研究HSP60對(duì)白牦牛睪丸支持細(xì)胞增殖的調(diào)控作用,本試驗(yàn)通過(guò)組合酶消化法分離培養(yǎng)白牦牛原代支持細(xì)胞,通過(guò)差速貼壁法和Tris-HCL低滲緩沖液進(jìn)行純化處理,運(yùn)用免疫熒光染色和Feulgen染色鑒定細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到96.2%高純度支持細(xì)胞。構(gòu)建HSP60過(guò)表達(dá)載體p IRES2-EGFP-HSP60,合成靶向siRNA沉默HSP60,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞后,經(jīng)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組HSP60 mRNA在24、48、72 h等時(shí)間點(diǎn)均上調(diào),沉默組HSP60 mRNA在24、48、72 h等時(shí)間點(diǎn)均下調(diào)。MTS試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況,過(guò)表達(dá)HSP60組中的支持細(xì)胞增殖效率各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組;沉默HSP60組中支持細(xì)胞的增值率各時(shí)間點(diǎn)均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,但差異不顯著。qPCR檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志基因細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA),結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)HSP60組的cyclin D1基因在48 h時(shí)的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組,PCNA基因的表達(dá)在24、48、72 h時(shí)均顯著高于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組;沉默HSP60組cyclin D1基因和PCNA基因的表達(dá)在24、48、72 h時(shí)均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,但差異不顯著。綜上,HSP60在白牦牛睪丸支持細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用是正向調(diào)控。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究HSP60對(duì)白牦牛睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的影響奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:HSP60 plays an important role in regulating testicular development and spermatogenesis. Sertoli cells are the only somatic cells in the testis that are directly associated with spermatogenic cells. In order to study the effect of HSP60 on the proliferation of testicular Sertoli cells of white yak, primary Sertoli cells of white yak were isolated and cultured by combined enzyme digestion. The cells were identified by immunofluorescence staining and Feulgen staining after purification by differential adherent method and Tris-HCL hypotonic buffer solution. 96.2% high purity Sertoli cells were obtained by flow cytometry. HSP60 overexpression vector pIRES2-EGFP-HSP60 was constructed and siRNA was synthesized to silence HSP60. after transient transfection of Sertoli cells, it was found that HSP60 mRNA in overexpression group was up-regulated at 244872 h. The proliferative efficiency of Sertoli cells in the over-expressed HSP60 group was significantly higher than that in the blank control group and the blank plasmid group, and the proliferation of Sertoli cells in the over-expressed HSP60 group was significantly higher than that in the blank control group and the blank plasmid group. The proliferative rate of Sertoli cells in the silencing HSP60 group was lower than that in the blank control group and the negative control group, but the difference was not significant. The results showed that the proliferation marker gene, cyclin D1) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA), were detected by qPCR. The expression of cyclin D1 gene in over-expressed HSP60 group was significantly higher than that in blank control group and empty plasmid group at 48 h, and was significantly higher than that in blank control group and empty plasmid group at 72 h. The expression of cyclin D1 gene and PCNA gene in the silencing HSP60 group was lower than that in the blank control group and the negative control group after 72 h. The effect of HSP60 on the proliferation of testicular Sertoli cells in white yak was positively regulated. The results of this study laid a theoretical foundation for further study of the effects of HSP60 on testicular development and spermatogenesis in white yak.
【作者單位】： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院;
【基金】：“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA02505-3)
【分類號(hào)】：S823.85

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本文編號(hào)：1627444