本文選題：偽狂犬病毒　切入點(diǎn)：UL21　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV),又叫做奧葉茲基氏病病毒(Aujeszky's disease virus)、豬皰疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1),屬于皰疹病毒科的α皰疹病毒亞科,是世界上廣泛存在的一種病原物。偽狂犬病毒的天然宿主分布廣泛,它能夠感染除高等靈長(zhǎng)類以外的大多數(shù)哺乳動(dòng)物,最主要的天然宿主是豬。偽狂犬病毒能引起母豬的呼吸道炎癥、流產(chǎn)、死胎,以及仔豬的死亡,在我國(guó)每年都能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。偽狂犬病毒基因組長(zhǎng)約為150Kb,其中包括長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)、短獨(dú)特區(qū)、內(nèi)部重復(fù)序列和末端重復(fù)序列。偽狂犬病毒基因組能夠編碼70種蛋白質(zhì),分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩種。pUL21位于偽狂犬病毒的內(nèi)層被膜,在皰疹病毒科中諸多病毒都存在且序列保守,應(yīng)該是維持其毒力的重要基因。UL21基因被認(rèn)為參與了病毒粒子的包裝過程,其缺失株在復(fù)制過程中出現(xiàn)大量的未加工的基因組串聯(lián)體,而且不含基因組的衣殼比例也大大增加。目前有研究表明,修復(fù)UL21突變的PRV Bartha株在神經(jīng)細(xì)胞中的逆向軸突感染的速度增加,表明pUL21可能與病毒運(yùn)輸有關(guān)。細(xì)菌人工染色體(bacteria artificial chromosome,BAC)是基于天然存在于大腸桿菌中的質(zhì)粒F因子設(shè)計(jì)的一種能夠容納大片段DNA插入序列的一種載體。BAC一經(jīng)問世,便被廣泛用于構(gòu)建真核生物基因組文庫(kù)。BAC文庫(kù)有穩(wěn)定性強(qiáng)、插入片段長(zhǎng)、復(fù)制快、突變?nèi)菀椎膬?yōu)點(diǎn)。BAC用于克隆皰疹病毒基因組始于1997年,其首次應(yīng)用于小鼠巨細(xì)胞病毒[1],自此皰疹病毒的研究翻開了新的篇章。由于通過BAC能夠在大腸桿菌中利用原核重組系統(tǒng)對(duì)病毒基因組進(jìn)行突變,省去了構(gòu)建重組毒時(shí)復(fù)雜繁瑣的過程,也節(jié)省了大量的時(shí)間,一時(shí)間該技術(shù)紛紛被用于各種皰疹病毒的基因編輯。本研究出于研究UL21缺失對(duì)PRV增殖影響和新建立的BAC平臺(tái)構(gòu)建突變株效率的目的,構(gòu)建了UL21缺失株rPRV-ΔUL21及其回復(fù)突變株rPRV-ΔUL21R,并通過空斑大小比較實(shí)驗(yàn)研究其生物學(xué)特性。在構(gòu)建rPRV-ΔUL21時(shí)先將擴(kuò)增的Kan表達(dá)盒電轉(zhuǎn)化含有pPRV Ea的GS1783,完成第一次Red重組;再分別誘導(dǎo)I-SceⅠ和Red操縱子表達(dá),完成第二次重組。從兩次重組的PCR驗(yàn)證來看,重組效率不是很穩(wěn)定,但每一輪都能挑到陽(yáng)性克隆,而且并沒有受到質(zhì)粒殘留的影響。該結(jié)果說明BAC基因編輯平臺(tái)穩(wěn)定可靠,能夠短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建重組病毒,為病毒基因功能研究節(jié)省大量的時(shí)間精力。最后western blot驗(yàn)證結(jié)果表明,rPRV-ΔUL21完全不表達(dá)UL21蛋白,說明PRV的UL21缺失株的構(gòu)建非常成功。隨后進(jìn)行的空斑大小比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,rPRV-ΔUL21感染MDBK細(xì)胞上所產(chǎn)生的空斑大小明顯小于PRV Ea株,但是減小的幅度并不大。這說明UL21的確影響PRV病毒在培養(yǎng)細(xì)胞上的增殖,但是其功能并不是復(fù)制必需的。為了確保UL21基因的突變沒有影響與其重疊的lncRNA CTO-L的表達(dá),本研究中采用了real time PCR來檢測(cè)感染病毒后12h的PK-15細(xì)胞中CTO-L的含量。檢測(cè)結(jié)果表明,rPRV-ΔUL21中對(duì)UL21的突變不僅基本沒有改變CTO-L的序列,同時(shí)也沒有影響其表達(dá)量。本研究在構(gòu)建重組毒時(shí)采用了新構(gòu)建的細(xì)菌人工染色體基因編輯平臺(tái),摸索出了一套正確的使用方法,方便后續(xù)其它成員構(gòu)建重組病毒研究基因功能。對(duì)UL21缺失病毒生理特性的研究則進(jìn)一步完善了對(duì)UL21基因功能的相關(guān)研究,加深了我們對(duì)UL21,尤其是對(duì)其與CTO-L之間關(guān)系的理解。
[Abstract]:Pseudorabies virus (Pseudorabies, virus, PRV), also called Aujesky's disease virus (Aujeszky's disease virus), porcine herpesvirus (Suid herpesvirus 1), alpha herpesvirus belongs to the herpes virus, is a pathogen widely exist in the world. The natural host of pseudorabies virus is widely distributed and it can infect most mammals in higher primates other than the natural host is the most important. Swine pseudorabies virus can cause respiratory tract inflammation, sow abortion, stillbirth, and piglet mortality, can cause serious economic losses every year in our country. Pseudorabies virus genome is about 150Kb, including long unique region, short unique region, internal repeats and terminal repeats. Pseudorabies virus genome encoding 70 proteins, the inner layer is divided into structural and non structural protein two.PUL21 in pseudorabies virus In the film, Herpesviridae in many viruses and conserved sequences,.UL21 gene is an important gene should maintain its virulence is thought to participate in the process of packing of virus particles, the mutant during replication not processing large genomic repeats, and does not contain the genome capsid is greatly increased. The proportion of at present, studies have shown that the repair of UL21 mutant PRV strain Bartha in nerve cells in retrograde axonal infection rate increased, indicating that pUL21 may be involved in viral transport. Bacterial artificial chromosome (bacteria artificial, chromosome, BAC) is based on a plasmid naturally found in Escherichia coli F factor design of a carrier can accommodate.BAC the large fragment of DNA insertion sequence was developed, it is widely used in the construction of the eukaryotic genome library of.BAC library has strong stability, long insert, copy fast, easy to jump The advantages of.BAC used for cloning the herpes virus genome in 1997, its first application in murine cytomegalovirus [1] herpes virus, since this study opened a new chapter. Through the BAC to the viral genome mutation using the Prokaryotic Recombinant system in Escherichia coli, the process to construct the recombinant virus, complex and cumbersome, but also save a lot of time, a time of the technology have been used in various gene editing of herpes simplex virus. Construct the mutant efficiency for the purpose of studying the effect of UL21 deficiency on the proliferation of PRV and the new BAC platform in this research, construction of the UL21 mutant rPRV- UL21 and its mutant strains of rPRV- UL21R, and the plaque size a comparative experimental study on its biological characteristics. In the construction of rPRV- Delta UL21 first amplified Kan expression cassette containing pPRV Ea GS1783 transformation, the completion of the first recombinant Red respectively induced I-Sce 1; And the expression of Red operon, completed second restructuring. From PCR to verify the two reorganization, the recombination efficiency is not very stable, but each round to pick up the positive clones, but was not affected by plasmid residue. The results suggest that BAC gene editing platform is stable and reliable, able to construct recombinant virus within a short period of time, save a large amount of time and energy for gene function. Finally western blot verification results show that the rPRV- UL21 did not express UL21 protein, indicating the construction of PRV UL21 mutant was very successful. Plaque size followed by comparison of experimental results show that rPRV- UL21 infection of plaque size produced by MDBK cells was less than PRV Ea strain, but the magnitude is not large. This shows that UL21 does reduce the effect of PRV on the proliferation of the virus in cultured cells, but its function is not essential for replication. In order to ensure that the UL21 mutation does not affect the The expression of lncRNA CTO-L and its rings overlap, this study uses real time PCR to detect the content of CTO-L 12h in PK-15 cells after infection. The detection results show that the rPRV- UL21 mutation in the UL21 sequence not only basically no change in CTO-L, but also did not affect its expression. The research in construction recombinant virus was used to construct new bacterial artificial chromosome gene editing platform, worked out a set of proper use method, convenient for other members of construction of recombinant virus gene function. Research on the physiological characteristics of UL21 deletion virus is to further improve the relevant research on UL21 gene function, our understanding of the UL21, especially the understanding of the relationship with CTO-L.

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1626806