鴨疫里默氏桿菌siderophore基因的克隆與表達

賴麗萍1 ,黃藏宇2

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,杭州  310058;2.浙江省嘉興市畜牧獸醫(yī)局,浙江嘉興 314000）

基因序列，克隆至pGEM-T easy載體后進行序列測定及分析。結(jié)果表明，閱讀框架全長為729 bp，編碼243個氨基酸。將該基因克隆到原核表達載體pET-28a后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，已成功表達28 ku的融合蛋白。

基因；克�。槐磉_

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎[1]。多見于1~8周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥，臨診上主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟失調(diào)和頭頸震顫，少數(shù)慢性病例出現(xiàn)頭頸歪斜等癥狀，在病變上以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎及部分病例出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎為特征，本病呈世界性流行，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的傳染病之一[2-4]。為了從根本上提高對鴨疫里默氏桿菌的預(yù)防控制水平，必須對鴨疫里默氏桿菌的分子致病機制進行全面深入的研究，對鴨疫里默氏桿菌鐵siderophore基因進行了克隆與表達，為進一步研究載鐵體的免疫與生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1  材料與方法

1.1  試驗材料

（公司；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自寶生物（大連）工程有限公司。

-TAGGATCCATGCCTAAGACACCGAAATG-3

siderophore基因序列。

）酶

瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接后轉(zhuǎn)化至卡那霉素的的

M    1    2

2000 bp

750 bp

1000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

100 bp

圖1 .siderophore基因的PCR擴增

2.2  目的基因的克隆與鑒定

15000 bp

M        1

5369 bp

750 bp

10000 bp

7500 bp

5000 bp

2500 bp

1000 bp

500 bp

結(jié)果

siderophore基因序列與之前已經(jīng)報道的鴨疫里默氏桿菌的相應(yīng)序列進行比較，發(fā)現(xiàn)同源性達到98%以上。

3  小結(jié)與討論

在自然界中絕大部分鐵卻要么是以細菌不能利用的化學(xué)形態(tài)的形式存在，要么是深埋于礦物顆粒中，所以自然界中細菌能夠利用的稱為生物有效鐵是很少的。在進化過程中，許多細菌進化獲得了攝取鐵的能力，大多通過細菌分泌一種叫鐵載體的小分子化合物(結(jié)構(gòu)不同，種類非常繁多)。鐵載體就是大多數(shù)微生物合成并輸出的一種螯合鐵的用于攝取鐵元素的低分子復(fù)合物[5,6]。它能夠?qū)㈣F離子緊緊束縛住，其他微生物就不能再將這些鐵據(jù)為己

M       1      2     3      4

28 ku

170 ku

34 ku

26 ku

43 ku

55 ku

72 ku

95 ku

130 ku

有了。鐵載體還可以幫助細菌將一些深埋于礦物或其他螯合物中的鐵離子拽出來，使得某些病原細菌敢于侵襲宿主細胞，如人體細胞中的鐵離子是與轉(zhuǎn)移蛋白、血紅蛋白這些組分緊密結(jié)合在一起的，但病原菌使用鐵載體奪取這些鐵離子很容易，鐵載體就被稱為這些病原侵犯人體的一把殺手锏。

等致病因子已有研究

參考文獻：

[2] 卡爾尼克 B W .禽病學(xué)[M].第10版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1999,195-202. 

rRNA homology group[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1993,43(4):768-776.

[4] Miethke M, Marahiel M A. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2007,71 (3): 413-451.

細菌營養(yǎng)競爭的有力武器

的篩選鑒定及其鐵載體特性研究

[8] Hu Q,Han X,Zhou X,et al. OmpA is a virulence factorofRiemerellaanatipestifer[J].Vet Microbiol,2011,150(3): 278-288.

              

                                                                                                             

甘肅省高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿建設(shè)項目進展良好

作為全國面積最大的紫花苜蓿草基地，甘肅省以“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”為契機，實施國家奶牛優(yōu)質(zhì)苜蓿標準化高產(chǎn)創(chuàng)建6 000hm2，配套田間灌溉設(shè)施，推廣苜蓿品種良種化開展標準化種植、機械化收割加工。目前項目建設(shè)穩(wěn)步推進，進展良好。

苜蓿被稱為“飼草之王”，是發(fā)揮奶牛遺傳潛力和提高牛奶質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)牧草。2012年開始，國家啟動實施“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動”，中央財政每年安排5.25億元，在奶牛主產(chǎn)省和苜蓿主產(chǎn)省開展奶牛優(yōu)質(zhì)苜蓿標準化高產(chǎn)創(chuàng)建。甘肅省制定了全省高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿示范建設(shè)項目實施方案，要求各地嚴格組織實施。對補助資金進行分賬核算、專款專用。由科研教學(xué)、技術(shù)推廣等方面專家實行包片掛鉤技術(shù)指導(dǎo)，有效提高了建設(shè)質(zhì)量水平。各地把發(fā)展苜蓿草產(chǎn)業(yè)作為優(yōu)化農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)和增加農(nóng)民收入的關(guān)鍵措施，在征地、用水、稅收、信貸等方面制定優(yōu)惠政策。目前，全省紫花苜蓿種植面積已達63.4萬hm2。（來源: 人民網(wǎng)甘肅頻道）

                                                                                                             

我國首次獲得成活iPS克隆豬

筆者從中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院獲悉，來自該研究院、浙江大學(xué)、華大基因研究所等機構(gòu)的科研人員，在世界上第一次獲得成活的iPS克隆豬，從而標志著我國在大動物iPS研究方面取得了標志性進展。

據(jù)介紹，豬的生理特征、組織細胞結(jié)構(gòu)和人類十分類似，因此，豬等大動物的誘導(dǎo)多能性干細胞（iPS細胞）研究受到世界各國的重視。但由于目前對iPS誘導(dǎo)機制還缺乏了解，全世界誘導(dǎo)獲得的豬iPS細胞制作克隆豬此前一直未能成功。

此項最新研究由中國工程院院士李寧和我國十多個研究單位共同完成。研究人員發(fā)現(xiàn)，外源基因的表達和表觀遺傳學(xué)可能是影響iPS克隆胚胎發(fā)育的主要原因。廣州生物醫(yī)藥健康研究院賴良學(xué)團隊將浙江大學(xué)肖磊實驗室獲得的豬iPS細胞分化4 ~6d，一方面使iPS細胞退出快速的細胞周期，，另一方面使外源基因表達下降后再進行核移植，分化后的iPS細胞核移植后體外發(fā)育囊胚率由原來的5%提高到20%左右。通過將這些分化iPS細胞克隆胚胎移植代孕受體，賴良學(xué)團隊在2011年率先獲得健康活潑的克隆小豬一頭。隨后，華大基因研究所杜玉濤課題組將豬iPS用去乙酰化抑制劑后，采用手工克隆方法于2012年獲得了4頭iPS克隆豬。                             

（來源: 中國畜牧獸醫(yī)報）

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