鴨疫里默氏桿菌siderophore基因的克隆與表達(dá)

賴麗萍1 ,黃藏宇2

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,杭州  310058;2.浙江省嘉興市畜牧獸醫(yī)局,浙江嘉興 314000）

基因序列，克隆至pGEM-T easy載體后進(jìn)行序列測(cè)定及分析。結(jié)果表明，閱讀框架全長(zhǎng)為729 bp，編碼243個(gè)氨基酸。將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，已成功表達(dá)28 ku的融合蛋白。

基因；克��；表達(dá)

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎[1]。多見(jiàn)于1~8周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥，臨診上主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟(jì)失調(diào)和頭頸震顫，少數(shù)慢性病例出現(xiàn)頭頸歪斜等癥狀，在病變上以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎及部分病例出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎為特征，本病呈世界性流行，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一[2-4]。為了從根本上提高對(duì)鴨疫里默氏桿菌的預(yù)防控制水平，必須對(duì)鴨疫里默氏桿菌的分子致病機(jī)制進(jìn)行全面深入的研究，對(duì)鴨疫里默氏桿菌鐵siderophore基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，為進(jìn)一步研究載鐵體的免疫與生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1  材料與方法

1.1  試驗(yàn)材料

（公司；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司。

-TAGGATCCATGCCTAAGACACCGAAATG-3

siderophore基因序列。

）酶

瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，連接后轉(zhuǎn)化至卡那霉素的的

M    1    2

2000 bp

750 bp

1000 bp

750 bp

500 bp

250 bp

100 bp

圖1 .siderophore基因的PCR擴(kuò)增

2.2  目的基因的克隆與鑒定

15000 bp

M        1

5369 bp

750 bp

10000 bp

7500 bp

5000 bp

2500 bp

1000 bp

500 bp

結(jié)果

siderophore基因序列與之前已經(jīng)報(bào)道的鴨疫里默氏桿菌的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)同源性達(dá)到98%以上。

3  小結(jié)與討論

在自然界中絕大部分鐵卻要么是以細(xì)菌不能利用的化學(xué)形態(tài)的形式存在，要么是深埋于礦物顆粒中，所以自然界中細(xì)菌能夠利用的稱為生物有效鐵是很少的。在進(jìn)化過(guò)程中，許多細(xì)菌進(jìn)化獲得了攝取鐵的能力，大多通過(guò)細(xì)菌分泌一種叫鐵載體的小分子化合物(結(jié)構(gòu)不同，種類(lèi)非常繁多)。鐵載體就是大多數(shù)微生物合成并輸出的一種螯合鐵的用于攝取鐵元素的低分子復(fù)合物[5,6]。它能夠?qū)㈣F離子緊緊束縛住，其他微生物就不能再將這些鐵據(jù)為己

M       1      2     3      4

28 ku

170 ku

34 ku

26 ku

43 ku

55 ku

72 ku

95 ku

130 ku

有了。鐵載體還可以幫助細(xì)菌將一些深埋于礦物或其他螯合物中的鐵離子拽出來(lái)，使得某些病原細(xì)菌敢于侵襲宿主細(xì)胞，如人體細(xì)胞中的鐵離子是與轉(zhuǎn)移蛋白、血紅蛋白這些組分緊密結(jié)合在一起的，但病原菌使用鐵載體奪取這些鐵離子很容易，鐵載體就被稱為這些病原侵犯人體的一把殺手锏。

等致病因子已有研究

參考文獻(xiàn)：

[2] 卡爾尼克 B W .禽病學(xué)[M].第10版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1999,195-202. 

rRNA homology group[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1993,43(4):768-776.

[4] Miethke M, Marahiel M A. Siderophore-based iron acquisition and pathogen control[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2007,71 (3): 413-451.

細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的有力武器

的篩選鑒定及其鐵載體特性研究

[8] Hu Q,Han X,Zhou X,et al. OmpA is a virulence factorofRiemerellaanatipestifer[J].Vet Microbiol,2011,150(3): 278-288.

              

                                                                                                             

甘肅省高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿建設(shè)項(xiàng)目進(jìn)展良好

作為全國(guó)面積最大的紫花苜蓿草基地，甘肅省以“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”為契機(jī)，實(shí)施國(guó)家奶牛優(yōu)質(zhì)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)化高產(chǎn)創(chuàng)建6 000hm2，配套田間灌溉設(shè)施，推廣苜蓿品種良種化開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)化種植、機(jī)械化收割加工。目前項(xiàng)目建設(shè)穩(wěn)步推進(jìn)，進(jìn)展良好。

苜蓿被稱為“飼草之王”，是發(fā)揮奶牛遺傳潛力和提高牛奶質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)牧草。2012年開(kāi)始，國(guó)家啟動(dòng)實(shí)施“振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)”，中央財(cái)政每年安排5.25億元，在奶牛主產(chǎn)省和苜蓿主產(chǎn)省開(kāi)展奶牛優(yōu)質(zhì)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)化高產(chǎn)創(chuàng)建。甘肅省制定了全省高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿示范建設(shè)項(xiàng)目實(shí)施方案，要求各地嚴(yán)格組織實(shí)施。對(duì)補(bǔ)助資金進(jìn)行分賬核算、�？顚Ｓ�。由科研教學(xué)、技術(shù)推廣等方面專家實(shí)行包片掛鉤技術(shù)指導(dǎo)，有效提高了建設(shè)質(zhì)量水平。各地把發(fā)展苜蓿草產(chǎn)業(yè)作為優(yōu)化農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)和增加農(nóng)民收入的關(guān)鍵措施，在征地、用水、稅收、信貸等方面制定優(yōu)惠政策。目前，全省紫花苜蓿種植面積已達(dá)63.4萬(wàn)hm2。（來(lái)源: 人民網(wǎng)甘肅頻道）

                                                                                                             

我國(guó)首次獲得成活iPS克隆豬

筆者從中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院獲悉，來(lái)自該研究院、浙江大學(xué)、華大基因研究所等機(jī)構(gòu)的科研人員，在世界上第一次獲得成活的iPS克隆豬，從而標(biāo)志著我國(guó)在大動(dòng)物iPS研究方面取得了標(biāo)志性進(jìn)展。

據(jù)介紹，豬的生理特征、組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和人類(lèi)十分類(lèi)似，因此，豬等大動(dòng)物的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）研究受到世界各國(guó)的重視。但由于目前對(duì)iPS誘導(dǎo)機(jī)制還缺乏了解，全世界誘導(dǎo)獲得的豬iPS細(xì)胞制作克隆豬此前一直未能成功。

此項(xiàng)最新研究由中國(guó)工程院院士李寧和我國(guó)十多個(gè)研究單位共同完成。研究人員發(fā)現(xiàn)，外源基因的表達(dá)和表觀遺傳學(xué)可能是影響iPS克隆胚胎發(fā)育的主要原因。廣州生物醫(yī)藥健康研究院賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)將浙江大學(xué)肖磊實(shí)驗(yàn)室獲得的豬iPS細(xì)胞分化4 ~6d，一方面使iPS細(xì)胞退出快速的細(xì)胞周期，，另一方面使外源基因表達(dá)下降后再進(jìn)行核移植，分化后的iPS細(xì)胞核移植后體外發(fā)育囊胚率由原來(lái)的5%提高到20%左右。通過(guò)將這些分化iPS細(xì)胞克隆胚胎移植代孕受體，賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)在2011年率先獲得健康活潑的克隆小豬一頭。隨后，華大基因研究所杜玉濤課題組將豬iPS用去乙�；种苿┖�，采用手工克隆方法于2012年獲得了4頭iPS克隆豬。                             

（來(lái)源: 中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào)）

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