本文選題：馬腺疫　切入點(diǎn)：馬鏈球菌馬亞種　出處：《黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：馬腺疫(Strangles)是由蘭斯菲爾德C型(Lancefield C)成員馬鏈球菌馬亞種(Streptococcus equi subspecies equi,S.equi)引起的一種馬屬動物傳染病,呈急性接觸性傳播,傳染性強(qiáng),對世界各國馬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)根據(jù)Genbank中已經(jīng)公布的S.equi重要的毒力因子及保護(hù)性抗原類M蛋白(Se M)的編碼基因序列,設(shè)計(jì)出一對引物,以S.equi現(xiàn)地分離株全DNA組為模板,成功擴(kuò)增出目的基因。將目的基因克隆至表達(dá)載體p GEX-6p-1中,將PCR鑒定和雙酶切鑒定均陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中,增菌培養(yǎng)后使用β-半乳糖苷異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,表明重組蛋白得到良好的表達(dá)�？扇苄栽囼�(yàn)顯示,重組蛋白以可溶性蛋白的形式存在于上清中,且蛋白分子量與預(yù)測值相符。Western blotting試驗(yàn)顯示,純化的重組蛋白能與S.equi陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),表明重組蛋白具有良好的抗原性,可以用于血清學(xué)檢測。以純化的重組蛋白為包被抗原,采用方陣滴定法,確定抗原的最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。通過對酶標(biāo)二抗工作濃度、顯色條件等步驟進(jìn)行優(yōu)化,成功建立間接ELISA方法。通過對S.equi標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行測定,計(jì)算出平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差以確定此方法的判定值。通過特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)對此ELISA方法的特異性、穩(wěn)定性進(jìn)行測定。用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對133份馬血清進(jìn)行檢測,并與IDEXX ELISA試劑盒進(jìn)行比較,本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA方法敏感性、特異性和符合率分別為70.59%、74.14%、73.68%。本研究為馬腺疫流行病學(xué)情況的調(diào)查提供了一種快速、簡便的血清學(xué)檢測方法,同時(shí)為S.equi診斷試劑盒的進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Strangles is an infectious disease caused by Streptococcus equi subspecies subspecies S.equii, a member of Lancefield C in Langsfeld. A pair of primers were designed according to the important virulence factor of S.equi and the gene sequence of protective antigen M protein se M, which have been published in Genbank. Using the whole DNA group of S.equi field isolate as template, the target gene was successfully amplified. The target gene was cloned into the expression vector p GEX-6p-1, and the recombinant plasmid, which was positive for both PCR identification and double enzyme digestion, was transformed into Escherichia coli Rosetta. After culture, 尾 -galactoside isopropylthioglycoside (IPTG) was used to induce expression at 37 鈩，

本文編號：1614614