本文選題：PRV　切入點：Neruo-2a　出處：《河南農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是α皰疹病毒亞科的重要成員之一,具有神經(jīng)嗜性和潛伏感染性,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。病毒感染宿主后miRNA在皰疹病毒的生活史及病原宿主互作中起到非常重要的調(diào)控作用。目前關(guān)于PRV體外的研究大多使用PK-15細胞,而在神經(jīng)細胞上的研究很少見到。本研究旨在建立PRV感染小鼠腦神經(jīng)瘤細胞(Neuro-2a)的細胞感染模型并測定miRNA表達譜,并對病原與宿主互作的可能機制進行探討。用PRV感染Neuro-2a細胞后,通過細胞病變觀察、TCID50測定、PCR及間接免疫熒光實驗,評估了PRV在Neuro-2a內(nèi)的增殖情況。結(jié)果顯示,PRV感染后,Neuro-2a產(chǎn)生典型的細胞病變;經(jīng)TCID50測定發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移,病毒滴度逐漸增高;PCR及間接免疫熒光試驗顯示PRV可在Neuro-2a上增殖。表明該PRV可適應Neuro-2a細胞,它可用于研究PRV感染、潛伏感染以及致病機制。建立檢測PRV IE180、EP0、VP16表達水平的熒光定量方法(qRT-PCR),并用于檢測PRV分別感染PK-15細胞及Neuro-2a細胞(MOI=5)后0h、2h、4h、6h,IE180、EP0、VP16的相對表達量。結(jié)果表明,在兩種不同的細胞內(nèi)PRV IE180、EP0、VP16的表達趨勢存在差異,提示PRV感染上皮細胞及神經(jīng)細胞時采用的“策略”存在差異。用Solexa測序技術(shù)及stem-loop qRT-PCR鑒定PRV感染Neuro-2a細胞后miRNA表達譜。利用生物信息學方法,分析宿主及PRV miRNA針對病毒靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡圖以及病毒感染對宿主mi RNA表達譜的影響。高通量的結(jié)果顯示,4h實驗組中檢測到PRV編碼的mi RNA共7種,分別為prv-miR-LLT1、prv-miR-LLT2、prv-miR-LLT4、prv-miR-LLT5、prv-miR-LLT6、prv-miR-LLT10a、prv-miR-LLT10b。這些miRNA的表達量都很低。28h實驗組中檢測到PRV編碼的miRNA共10種,比4h實驗組多出3種,分別為prv-miR-LLT3、prv-miR-LLT11a、prv-miR-LLT11b。28h實驗組中PRV編碼的miRNA表達量均上調(diào)。miRBase數(shù)據(jù)庫中公布的PRV編碼的13種miRNA,prv-miR-LLT7、prv-miR-LLT8、prv-miR-LLT9在4h和28h實驗組中均未表達。通過比較可知PRV感染Neuro-2a細胞后,有4種宿主mi RNA(miR-146b-5p、miR-714、miR-466k、miR-6538)在感染后4h上調(diào)表達。感染后28h時,7種miRNA(miR-301a-3p、miR-1249-3p、miR-6538、miR-714、miR-19a-3p、miR-101c、miR-99b-5p)差異表達,其中只有miR-99b-5p下調(diào)表達,其余上調(diào)表達。相對于4h實驗組,在28h實驗組中PRV編碼的miRNA,僅有prv-miR-LLT1的表達量顯著上調(diào)。用stem-loop qRT-PCR方法驗證了高通量測序結(jié)果的可靠性。差異表達miRNA靶基因GO分析結(jié)果表明,宿主miRNA調(diào)控的基因主要影響細胞組分、分子功能及生物學過程;Pathway分析結(jié)果顯示宿主miRNA調(diào)控的基因主要參與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)信號通路、促分裂素原活化蛋白激酶信號通路、神經(jīng)信號傳遞通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)通路、焦點粘連。用差異表達的宿主及病毒miRNA和病毒靶基因做基因網(wǎng)絡圖顯示宿主及病毒生物miRNA可靶向多個病毒靶基因形成復雜的網(wǎng)絡。同時根據(jù)測序數(shù)據(jù)預測到小鼠的多條miRNA,但仍需要實驗進一步驗證。上述的研究結(jié)果為進一步深入研究miRNA調(diào)控α皰疹病毒的嗜神經(jīng)性,潛伏感染性及免疫逃避等奠定了基礎。
[Abstract]:Pseudorabies virus (Pseudorabies virus PRV) is an important member of alpha herpesvirus, with nerve tropism and latent infection, causing huge economic losses to the pig industry. Virus infection of the host in the life history of herpes simplex virus and pathogen host miRNA interaction plays an important role in the present study. About PRV in vitro to use most of the PK-15 cells, and the research on nerve cells are rarely seen. The purpose of this study was to establish PRV infected cells (Neuro-2a cells) infection model and determination of miRNA expression, discuss the possible mechanism of pathogen interactions with host cells. PRV Neuro-2a cells infected by the CPE, TCID50 assay, PCR and indirect immunofluorescence assay, evaluated the proliferation of PRV in Neuro-2a. The results showed that after PRV infection, Neuro-2a caused typical cytopathic effect by TCID50; Was found with the passage of time, the virus titer gradually increased; PCR and indirect immunofluorescence test showed PRV proliferation in Neuro-2a. That the PRV can be adapted to Neuro-2a cells, it can be used to study PRV infection, latent infection and pathogenesis. The establishment of PRV detection IE180, EP0, fluorescence quantitative method the expression level of VP16 (qRT-PCR) and, for the detection of PRV were used to infect PK-15 cells and Neuro-2a cells (MOI=5) after 0h, 2h, 4h, 6h, IE180, EP0, the relative expression of VP16. The results showed that in two different cell PRV in IE180, EP0, VP16 expression trend differences, suggesting the presence of epithelial cells and infected by PRV nerve cell "strategy". The difference by Solexa sequencing technology and stem-loop qRT-PCR identification of PRV infected Neuro-2a cells. The expression profile of miRNA by Bioinformatics Method and PRV miRNA analysis of the host for the virus gene regulatory networks And the virus infection on host mi RNA expression. High throughput results show that 4H in the experimental group detected mi RNA PRV encoding a total of 7, respectively, prv-miR-LLT1, prv-miR-LLT2, prv-miR-LLT4, prv-miR-LLT5, prv-miR-LLT6, prv-miR-LLT10a, prv-miR-LLT10b. expression of these miRNA are low in.28h experimental group were detected in PRV encoding the miRNA is 10, 3 more than the 4H experimental group, respectively prv-miR-LLT3, prv-miR-LLT11a, 13 miRNA, PRV encoding prv-miR-LLT11b.28h in the experimental group the expression of miRNA encoding PRV released increased in.MiRBase database of prv-miR-LLT7, prv-miR-LLT8 and prv-miR-LLT9 were not expressed in 4H and 28h in the experimental group. By comparison PRV infected Neuro-2a cells, there are 4 kinds of host mi RNA (miR-146b-5p, miR-714, miR-466k, miR-6538) in the upregulation of 4H expression after infection. 28h after infection, 7 kinds of miRNA (miR-301a-3p, miR-1249-3p, miR -6538, miR-714, miR-19a-3p, miR-101c, miR-99b-5p) differential expression, the expression of only miR-99b-5p, the expression of 4H. Compared with the experimental group, the experimental group 28h PRV encoding miRNA, expression of prv-miR-LLT1 only increased significantly. By using stem-loop qRT-PCR method to verify the reliability of high-throughput sequencing results. The differential expression of miRNA target GO gene analysis showed that the host miRNA gene mainly affects the cellular component, molecular function and biological process; the Pathway analysis results showed that the host miRNA regulated genes mainly involved in phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) protein serine threonine kinase (Akt) pathway, mitogen activated protein kinase pathway, nerve signal pathway, regulation of actin cytoskeleton and focal adhesion pathway. The host miRNA and viral target genes with differential expression gene network Show host and virus biological miRNA targeting multiple viral target genes form a complex network. At the same time according to the sequencing data to predict multiple miRNA mice, but still need to be validated by experiments. The results of the study for further study on the regulation of miRNA alpha herpes virus tropism by God, and laid the foundation of latent infection immune escape.

【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：1610894