本文選題：白芍　切入點(diǎn)：抗炎　出處：《西南大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：炎癥(Inflammation)為機(jī)體受到有害刺激時(shí)所產(chǎn)生的一種抗損傷的防御性病理反應(yīng),其臨床特征為局部的紅(Redness)、腫(Swelling)、熱(Heat)、痛(Pain)和機(jī)體功能障礙(Loss of function),其發(fā)熱、紅腫、疼痛等臨床癥候與中醫(yī)的“熱”證型所伴有的高熱、汗出、舌紅苔黃、肌膚生瘡發(fā)熱等癥候相似。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“熱”和“火”是炎癥的主要病因病機(jī),機(jī)體感受熱邪、或外感寒邪化熱、或內(nèi)有郁積化熱而致“熱”證,臨床多見(jiàn)高熱、煩渴、汗出等癥。根據(jù)“熱”的證型以及不同發(fā)展階段,中醫(yī)對(duì)“熱”證的治則有清熱瀉火、滋陰清熱、清泄里熱、清上溫下等。白芍是常用中藥,有白芍、赤芍之分,二者各具不同的功效�！夺t(yī)學(xué)啟源》中記載白芍功能主治包括“安脾經(jīng)、治腹痛、瀉肝”,古方中也不乏有以白芍為君藥的方劑,如白芍散,黃蓮白芍湯等。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中關(guān)于白芍的抗炎免疫活性及作用機(jī)制的研究報(bào)道甚少,而炎癥和免疫在組織、細(xì)胞、分子水平上是緊密聯(lián)系不可分割的過(guò)程,因此,本研究擬采用急性炎癥模型和疼痛反應(yīng)模型,觀察白芍(以下簡(jiǎn)稱Pae)的抗炎鎮(zhèn)痛活性,并從病理組織學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等角度初步探討其部分固有免疫分子機(jī)制,以期明確白芍抗炎免疫藥理活性的作用機(jī)理,為中藥白芍的進(jìn)一步研發(fā)和有效運(yùn)用提供理論依據(jù)。其試驗(yàn)主要結(jié)果及結(jié)論如下：1.白芍的抗炎鎮(zhèn)痛活性研究試驗(yàn)采用二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致毛細(xì)血管通透性改變?cè)囼?yàn)和]醋酸致小鼠扭體反應(yīng)試驗(yàn)研究白芍的抗炎鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果表明：白芍的三個(gè)劑量(10g/kg、5g/kg和2.5g/kg)均能不同程度抑制小鼠耳腫脹,其高劑量(10g/kg)、中劑量(5g/kg)組的小鼠耳腫脹率分別為22.39%(P0.05)、28.90%(P0.01),顯著或極顯著降低二甲苯致小鼠的耳腫脹。白芍高、中、低劑量的腹腔毛細(xì)血管通透性增加抑制率分別為25.12%、41.87%、4.43%,其白芍的中劑量(5g/kg)組的腹腔毛細(xì)血管通透性增加抑制率顯著高于陰性對(duì)照組(P0.05)。白芍的三個(gè)劑量均能降低醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù),以中劑量(5g/kg)的效果最佳,扭體反應(yīng)次數(shù)抑制率為43.88%,與陰性對(duì)照組差異顯著(P0.05)。結(jié)果提示：白芍可減輕炎癥、舒緩疼痛,具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛活性。2.小鼠膿毒癥模型的建立及白芍對(duì)小鼠膿毒癥的干預(yù)效果通過(guò)腹腔注射LPS建立小鼠膿毒癥模型,進(jìn)行白芍干預(yù)小鼠膿毒癥的試驗(yàn)研究。觀察LPS膿毒癥模型復(fù)制后2h～72h小鼠的臨床癥候,表現(xiàn)為：LPS攻毒后小鼠山現(xiàn)食欲下降,行動(dòng)緩慢、倦怠、嗜睡、被毛蓬松等癥狀,剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)皮下、腸系膜充血或山血,部分肝組織可見(jiàn)白色點(diǎn)狀壞死；組織學(xué)觀察可見(jiàn)LPS模型組在攻毒后前期和后期小鼠肝細(xì)胞界限不清或消失,肝竇淤血,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞變性,部分呈彌漫性壞死；染毒后12h～36h病理變化最明顯,表現(xiàn)為中央靜脈擴(kuò)張充血,靜脈壁細(xì)胞脫落,甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡壞死。經(jīng)白芍干預(yù)治療后,小鼠的臨床癥狀及剖檢癥狀較LPS模型組有所減輕,肝組織結(jié)構(gòu)有不同程度的損傷,肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰,見(jiàn)少量出血,肝細(xì)胞排列較紊亂,部分出現(xiàn)變性壞死,可見(jiàn)未完全溶解的核碎屑；48h少數(shù)肝細(xì)胞炎性浸潤(rùn)伴有輕度水腫,胞漿疏松化,中央靜脈少許擴(kuò)張,周圍有少量的肝細(xì)胞壞死及炎性浸潤(rùn)：72h肝組織結(jié)構(gòu)清晰,有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞較完整;白芍干預(yù)治療組小鼠死亡數(shù)較LPS膿毒癥組少,且其組織病理變化與地塞米松干預(yù)組小鼠相近。表明白芍可減輕LPS膿毒癥小鼠的臨床癥候、病理?yè)p傷及減少小鼠死亡數(shù),對(duì)小鼠膿毒癥具有保護(hù)作用。3.白芍對(duì)LPS膿毒癥小鼠肝組織中TLR4及下游相關(guān)信號(hào)分子mRNA表達(dá)量的影響分子固有免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),TLR4能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),激活MyD88、NF-κB等基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而發(fā)揮固有免疫作用,因此,分析信號(hào)通路中重要因子表達(dá)量的變化可以初步判定藥物的作用靶位。本試驗(yàn)分析TLR4/MyD88/NF-KB信號(hào)通路中幾個(gè)重要節(jié)點(diǎn)分子表達(dá)量的變化,初步確定白芍發(fā)揮抗炎作用的固有免疫機(jī)制及其可能作用靶標(biāo)。試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)小鼠肝組織中TLR4、 MyD88、NF-κB、 TNF-α、IL-1p、IL-4和IL-10的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,LPS模型組小鼠的TLR4、MyD88、NF-κB等目的基因mRNA表達(dá)水平在12h-36h均不同程度升高,其相對(duì)表達(dá)量分別12h、36h、24h達(dá)到峰值,顯著或極顯著高于陰性對(duì)照組(P0.05或P0.01)。而經(jīng)白芍干預(yù)處理的小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB總體水平均低于未給予藥物干預(yù)的LPS模型組,分別在12h(7.15±0.23 vs 9.44±1.12)、36h(4.44±0.98 vs 13.06±1.7)、24h(3.29±0.43 vs 7.34±2.06)極顯著低于LPS模型組；TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平亦顯著降低(2.37±0.61 vs 7.34±2.06)、(14.92±2.07 vs 15.52±1.12); IL-4的表達(dá)水平均高于LPS模型組小鼠,分別在6h、24h-72h與模型組比較差異顯著(P0.05), IL-10 mRNA表達(dá)水平均略低于LPS模型組小鼠,36h其表達(dá)水平與模型組比較差異極顯著P0.01),但其余時(shí)間點(diǎn)與LPS模型組的差異均不顯著。研究結(jié)果表明：TLR4可識(shí)別LPS,并激活TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路,提高促炎因子相關(guān)基因TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)的表達(dá)水平,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生；白芍可通過(guò)TLR4/MyD88/NF-KB信號(hào)通路,抑制LPS受體TLR4及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MyD88、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10的mRNA水平的表達(dá),達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)效果。提示TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路中MyD88、NF-κB等各節(jié)點(diǎn)重要分子可能是白芍發(fā)揮抗炎作用的靶標(biāo)。4.白芍對(duì)LPS膿毒癥小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1含量的影響TNF-α、IL-1β是機(jī)體重要的致炎因子,其合成和分泌能夠激活炎癥反應(yīng)。IL-4、IL-10是重要的抗炎因子及免疫抑制劑,二者可強(qiáng)烈抑制免疫細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等炎癥介質(zhì),抑制單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。同時(shí),HMGB1作為一種晚期炎癥介質(zhì),是膿毒癥的重要調(diào)節(jié)因子。中藥機(jī)制之一為影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成和釋放來(lái)發(fā)揮其抗炎作用。基于此,本試驗(yàn)通過(guò)建立小鼠LPS膿毒癥模型,以及用白芍干預(yù)后2h～72h小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1含量的檢測(cè),評(píng)價(jià)白芍對(duì)小鼠LPS膿毒癥的抗炎效果。試驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA方法,建立小鼠血清中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性相關(guān)系數(shù)R20.99,表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于計(jì)算待檢樣品的含量。小鼠經(jīng)LPS處理后,各時(shí)間點(diǎn)血清中致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、HMGB1含量均高于陰性對(duì)照組,分別在6h、12h、36h達(dá)到最大值。而經(jīng)過(guò)白芍處理后,TNF-α、IL-1β、 HMGB1含量峰值的分別為達(dá)到328.63±16.49pg/ml、176.38±11.70pg/ml和97.73±11.85ng/ml,較LPS模型組有顯著下降(P0.01或P0.05)；IL-4水平在36h(128.76±24.68ng/ml)、 48h(95.71±57.09pg/ml)顯著高于膿毒癥模型組(P0.05),而IL-10的含量顯著高于同時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照組,在36h-48h顯著低于LPS模型組,但與LPS+地塞米松干預(yù)組差異不顯著(P0.05)。研究表明,白芍可顯著抑制LPS膿毒癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-1β、HMGB1的合成與釋放,促進(jìn)IL-4、IL-10的合成與釋放。提示白芍可平衡、調(diào)節(jié)促炎因子TNF-α、IL-1β,抗炎因子IL-4、IL-10及炎癥晚期介質(zhì)HMGB1等蛋白的合成與釋放來(lái)發(fā)揮其抗炎作用。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S853.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1607579