本文選題：微小RNA　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄調(diào)控　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬病毒。它是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病病原,感染人和動(dòng)物后引起乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)。據(jù)統(tǒng)計(jì),亞洲地區(qū)每年JE發(fā)病人數(shù)達(dá)35000-50000例左右,死亡10000例左右,而存活的患者中接近半數(shù)的人伴有永久的神經(jīng)后遺癥。同時(shí),JE也是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一,主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎,公豬睪丸炎。靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng),并引發(fā)過(guò)度的神經(jīng)炎癥反應(yīng),是JEV導(dǎo)致人和動(dòng)物發(fā)病、死亡的主要因素,但其分子機(jī)制仍待闡明。微小RNA(microRNA)是一類約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的非編碼RNA分子,通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合,抑制靶基因mRNA的翻譯或降解mRNA,從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。microRNA作為一種調(diào)控因子,廣泛參與細(xì)胞增殖分化、癌癥和細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),microRNA還能參與病毒感染及調(diào)控TLR和RIG-I介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。盡管如此,microRNA是否參與JEV感染仍不清楚。因此,本研究旨在以miR-15b為研究對(duì)象,探索JEV感染膠質(zhì)細(xì)胞后介導(dǎo)miR-15b表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制及其生物學(xué)功能。具體內(nèi)容如下:1.JEV感染上調(diào)miR-15b的表達(dá)在JEV感染的人星形膠質(zhì)細(xì)胞(U251細(xì)胞)和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2細(xì)胞)中,用熒光定量PCR的方法檢測(cè)miR-15b的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)miR-15b的表達(dá)顯著上調(diào),并呈時(shí)間和劑量依賴性。檢測(cè)JEV感染的小鼠腦組織中miR-15b的水平,發(fā)現(xiàn)miR-15b的表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明JEV感染在體內(nèi)和體外都能上調(diào)miR-15b的表達(dá)。2.c-Rel和CREB調(diào)控miR-15b的轉(zhuǎn)錄本研究發(fā)現(xiàn)在JEV感染細(xì)胞中,mi R-15b的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri-miR-15b)與成熟miR-15b的變化趨勢(shì)一致,說(shuō)明JEV在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控miR-15b的表達(dá)。通過(guò)分析miR-15b啟動(dòng)子區(qū)域,我們發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域上含有轉(zhuǎn)錄因子c-Rel和CREB結(jié)合位點(diǎn)。為了確定c-Rel和CREB能與這些位點(diǎn)結(jié)合從而調(diào)控mi R-15b的轉(zhuǎn)錄,我們突變了啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并構(gòu)建到報(bào)告質(zhì)粒上,啟動(dòng)子活性結(jié)果顯示c-Rel和CREB能結(jié)合到miR-15b的啟動(dòng)子區(qū)域,調(diào)控JEV誘導(dǎo)的miR-15b的轉(zhuǎn)錄。此外,染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明c-Rel和CREB可以直接結(jié)合到miR-15b的啟動(dòng)子區(qū)域。為了進(jìn)一步探究調(diào)控miR-15b表達(dá)的信號(hào)通路,我們利用信號(hào)通路抑制劑及siRNA處理細(xì)胞,結(jié)果顯示ERK和NF-κB參與調(diào)控JEV激活的miR-15b的表達(dá),并且miR-15b的表達(dá)依賴RIG-I。3.mi R-15b通過(guò)靶向RNF125調(diào)控JEV介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為了探究miR-15b在JEV感染過(guò)程中的生物學(xué)功能,通過(guò)gain of function和loss of function實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)miR-15b正向調(diào)控JEV誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子及IFN-β的表達(dá)。對(duì)miR-15b發(fā)揮功能的分子機(jī)制進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)RIG-I的負(fù)調(diào)節(jié)子ring finger protein 125(RNF125)是mi R-15b的一個(gè)直接靶標(biāo)。miR-15b能結(jié)合到RNF125 mRNA的3’UTR區(qū)域,抑制內(nèi)源RNF125的表達(dá)。此外,mi R-15b通過(guò)靶向RNF125增加RIG-I的表達(dá)水平,進(jìn)而促進(jìn)RIG-I信號(hào)通路的激活。進(jìn)一步通過(guò)靶基因RNF125的回復(fù)實(shí)驗(yàn),證明miR-15b通過(guò)靶向RNF125調(diào)控JEV介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。4.體內(nèi)驗(yàn)證miR-15b的功能為了在JEV感染小鼠模型中驗(yàn)證miR-15b的促炎作用,小鼠尾靜脈注射化學(xué)修飾的miR-15b抑制劑antagomir-15b,小鼠未表現(xiàn)不良反應(yīng)。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示antagomir-15b能抑制JEV感染小鼠腦組織中miR-15b的表達(dá)水平,回復(fù)RNF125的表達(dá),降低炎性細(xì)胞因子的水平。通過(guò)對(duì)小鼠腦組織切片進(jìn)行HE染色、免疫組化(IHC)及TUNEL分析,發(fā)現(xiàn)注射antagomir-15b的小鼠腦部病理變化減輕、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化降低及神經(jīng)元的凋亡減少。此外,antagomir-15b能提高致死劑量JEV感染小鼠的存活率,降低腦組織中病毒載量。本研究首次證明了mi R-15b在JEV與宿主細(xì)胞相互作用中扮演重要角色,初步闡明了JEV誘導(dǎo)miR-15b表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制,揭示了miR-15b在JEV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制,為深入揭示JEV誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制及腦炎性疾病的治療提供了一種新思路。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65;R373.31

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1 朱碧波;乙型腦炎病毒誘導(dǎo)miR-15b的表達(dá)調(diào)控及功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1576563