本文選題：產(chǎn)氣莢膜梭菌　切入點：延遲裂解型沙門菌　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于環(huán)境及動物的胃腸道部位,一定條件下,可以成為致病菌,給畜牧業(yè)造成巨大的危害和損失。因其菌株類型比較多,產(chǎn)生毒素種類比較豐富,所以控制其有效的方法就是運用疫苗來預防它造成疾病的感染。延遲裂解型沙門菌系統(tǒng)作為一種新型外源蛋白表達體系,一方面在免疫動物后,可以確保質(zhì)粒載體在體內(nèi)編碼保護性抗原的穩(wěn)定性,同時選用阿拉伯糖(arabinose,Ara)作為篩選標記,避免了耐藥標記的應用,對環(huán)境無害,另一方面是通過口服方式擺脫了針劑帶來的成本和安全問題,方法簡便安全,是一種比較理想的疫苗載體。α毒素C末端(plcC)和NetB毒素作為產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的重要組成部分,已被證實具有良好的免疫原性。Fba是產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的一種代謝酶,稱為二磷酸果糖酶,推測Fba對于產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素的產(chǎn)生有至關(guān)重要的作用,因此其本身也是一種潛在的抗原蛋白。本試驗選用延遲裂解型沙門菌作為抗原遞送載體,構(gòu)建了表達Fba蛋白的重組沙門菌,進而構(gòu)建了同時表達plcC、NetB和Fba三種抗原的新型重組沙門菌,并對它們的免疫效果進行分析和評價。本試驗研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌Fba蛋白的純化及血清特異性Fba多抗的制備本研究首先由生物公司合成A型產(chǎn)氣莢膜梭菌Fba基因序列,利用PCR技術(shù)擴增帶Fba基因并將其克隆到表達載體pET-30a中,獲得pET-30a-Fba重組質(zhì)粒。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細胞中,在卡那霉素的篩選壓力下,獲得陽性轉(zhuǎn)化子BL21(pET-30a-Fba),并經(jīng)過IPTG誘導表達His-Fba蛋白,通過His-tag Ni柱親和層析純化后,回收較高濃度的His-Fba蛋白,免疫新西蘭大白兔制備血清特異性Fba多抗。(2)pYA3681-Fba、pYA3681-plcC-NetB-Fba兩個重組質(zhì)粒的構(gòu)建及抗原在χ11802中的表達。通過基因工程方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pYA3681-Fba和pYA3681-plcC-NetB-Fba,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌χ6212感受態(tài)中,使其能穩(wěn)定表達抗原,再將能穩(wěn)定復制的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到χ11802感受態(tài)中,重組菌χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)經(jīng)IPTG誘導后表達蛋白,通過Western blotting檢測表達蛋白的免疫反應原性。實驗結(jié)果表明:成功構(gòu)建了χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延遲裂解型沙門菌,Western blotting驗證表達蛋白的免疫反應原性良好,為下一步進行延遲裂解型沙門菌免疫動物以及攻菌實驗奠定基礎。(3)χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延遲裂解型沙門菌免疫保護效果的研究按免疫程序?qū)ⅵ?1802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延遲裂解型沙門菌通過口服方式喂飼小鼠。三免疫結(jié)束后的一周,用間接ELISA方法檢測小鼠體內(nèi)LPS、plcC、NetB及Fba特異性Ig G和SIg A的含量,ELISA試劑盒檢測小鼠血清內(nèi)細胞因子的分泌情況。流式細胞術(shù)檢測各免疫器官中T淋巴細胞,B淋巴細胞以及DC細胞的活化情況。攻菌后監(jiān)測小鼠體重,計算體重丟失率及存活率,并對小鼠小腸做病理切片,分析小腸病理損傷的變化。試驗結(jié)果顯示:χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延遲裂解沙門菌可以有效地提高小鼠體內(nèi)特異性Ig G和SIg A的水平。攻菌后新型延遲裂解沙門菌組小鼠體重丟失較少且恢復較快,存活率也明顯高于其它對照組,χ11802(pYA3681-Fba)組存活率為20%,χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)組存活率為40%,并且小腸絨毛的完整性高于對照組,且三抗原共表達重組菌免疫效果更佳。綜上所述:χ11802(pYA3681-Fba)和χ11802(pYA3681-plcC-NetB-Fba)延遲裂解型沙門菌構(gòu)建并表達成功。重組沙門菌能有效刺激小鼠上調(diào)脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中CD11C~+CD83~+比例,上調(diào)脾臟中CD3~+CD4~+IL-4~+和CD3~+CD4~+IFNγ~+比例,上調(diào)腸系膜淋巴結(jié)中B220~+Ig A~+的比例。同時刺激小鼠產(chǎn)生特異性Ig G和s Ig A抗體,上調(diào)小鼠IL-4和IFN-γ細胞因子,為產(chǎn)氣莢膜梭菌新型口服疫苗制劑的研制成功奠定基礎。
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【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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本文編號：1573905