本文選題：鵝　切入點(diǎn)：肥肝　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：microRNA(miRNA)是一類長約21-23nt的非編碼RNA分子,其對基因的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮重要作用。已有研究表明miRNA在人和小鼠肝臟脂肪代謝障礙中起著重要調(diào)控作用。鵝肝臟沉積脂肪能力很強(qiáng)但不會有明顯的病理癥狀,是研究肝臟脂類代謝很好的模型。本研究采用第二代高通量測序方法,檢測鵝肥肝形成中差異表達(dá)的miRNA,利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA的靶基因,同時(shí)結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測序研究結(jié)果,構(gòu)建miRNA與基因間調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選出可能起核心作用的miRNA和靶基因。然后從篩選結(jié)果中挑選部分重要miRNA和對應(yīng)靶基因(miRNA-33和CROT基因),利用鵝原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、Western Blot等技術(shù)進(jìn)行靶向關(guān)系驗(yàn)證及調(diào)控機(jī)制研究,為進(jìn)一步闡明鵝肥肝形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:1.朗德鵝填飼效果及小RNA測序質(zhì)量:70日齡的朗德鵝在經(jīng)過19天的填飼后,較對照組其體重和肝重均發(fā)生顯著的增長(P0.05)。其中,填飼組和對照組鵝體重分別為7.57 ±0.48 kg 以及 3.87 ±0.25 kg(n=6),肝重分別為 826.26 ± 182.26 g 和 80.63 ± 12.80 g,肝體比(肝重/體重)分別為10.86%和2.08%。同時(shí),填飼組鵝肝臟的顏色也由正常的深紅色變?yōu)橹靖蔚湫偷狞S褐色,表明填飼后實(shí)驗(yàn)鵝確實(shí)產(chǎn)生了明顯的脂肪肝。對送測樣本的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測表明,RNA的樣品濃度≥80ng/μL,RNA無降解,無污染,總體質(zhì)量較高。2.鵝肥肝形成過程中差異miRNA分析及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建:通過對鵝不同填飼階段(7天、14天和19天)填飼組和對照組的肝臟進(jìn)行小RNA測序,并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接和注釋,最終獲得了 1163個(gè)有注釋信息的miRNA。在77日齡、84日齡、89日齡三個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較填飼組和對照組不同階段肝臟miRNA表達(dá)的差異,結(jié)果在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別篩選出30(17個(gè)填飼組上調(diào))、48(36個(gè)填飼組上調(diào))和151(114個(gè)填飼組上調(diào))個(gè)差異表達(dá)的miRNA。結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)對差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測,在77日齡、84日齡、89日齡三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別獲得234個(gè)、445個(gè)、845個(gè)預(yù)測靶基因,其中在填飼組上調(diào)的預(yù)測靶基因分別為156個(gè)、270個(gè)、211個(gè)。對獲得的預(yù)測靶基因進(jìn)行KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn),起關(guān)鍵調(diào)控作用的顯著富集通路包括:碳水化合物、脂質(zhì)和氨基酸代謝通路,細(xì)胞生長死亡通路,免疫系統(tǒng)通路等。以差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測結(jié)果為基礎(chǔ),使用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因的互作關(guān)系并構(gòu)建miRNA與基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3.miRNA-33及其靶基因CROT的表達(dá)調(diào)控研究:本課題組在前期的工作中發(fā)現(xiàn)miRNA-33與脂肪代謝緊密相關(guān),并通過實(shí)驗(yàn)對其靶基因進(jìn)行了初步的預(yù)測和研究,發(fā)現(xiàn)CROT基因?yàn)槠淇赡艿陌谢�。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),miRNA-33在填飼的不同階段(尤其是填飼后期)均發(fā)生了表達(dá)量的上調(diào)。因此,本試驗(yàn)對miRNA-33及其靶基因CROT的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。熒光定量PCR結(jié)果與小RNA測序結(jié)果相符,證實(shí)了 miRNA-33在填飼各階段肝臟中均顯著上調(diào)。此外,miRNA-33在腹脂和胸肌中其表達(dá)水平也受填飼的影響而顯著升高,表明miRNA確實(shí)與填飼引起的脂肪代謝變化相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miRNA-33的預(yù)測靶基因CROT基因在填飼各階段肝臟中的mRNA水平均顯著下調(diào),且在19天填飼組中的蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào),這與miRNA-33的表達(dá)趨勢正好相反,表明在鵝肥肝形成過程中miRNA-33可能參與CROT基因的表達(dá)調(diào)控。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在鵝原代肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-33 mimic和miRNA-33質(zhì)粒后,CROT基因的mRNA表達(dá)受到了顯著抑制;而在鵝原代肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-33 inhibitor之后,CROT基因的mRNA表達(dá)則顯著升高,表明CROT基因確實(shí)為miRNA-33的靶基因。使用脂肪肝形成相關(guān)因子(葡萄糖和胰島素)處理鵝原代肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn),葡萄糖處理可以顯著抑制miRNA-33的表達(dá)并誘導(dǎo)CROT基因,而胰島素則可以顯著誘導(dǎo)miRNA-33的表達(dá)并抑制CROT基因的表達(dá)。該結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了 miRNA-33與CROT基因的靶向調(diào)控關(guān)系,而且說明填飼引起的鵝肝臟中發(fā)生的高胰島素血癥可能是導(dǎo)致miRNA-33表達(dá)上調(diào)的主要原因之一,繼而調(diào)控CROT基因,參與鵝肥肝的形成。
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【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S835

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1 鄭云;鵝肥肝形成過程中差異表達(dá)miRNA篩選及miRNA-33的表達(dá)調(diào)控研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2017年

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本文編號：1573625