本文選題：新城疫病毒　切入點：單鏈抗體　出處：《廣西大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一類禽類呼吸道疾病,感染宿主高度致死,因此對中國乃至全球的家禽業(yè)造成巨大的威脅,至今仍無特異性治療藥物。單鏈抗體(scFv)是免疫球蛋白最小的功能性結(jié)構(gòu)單元,具有抗原結(jié)合活性,且在脊椎動物與非脊椎動物中均能表達。單鏈抗體除了應用于醫(yī)學診斷與治療,還具有中和病毒的能力。本研究探索利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建抗新城疫病毒單鏈抗體真核表達載體,分別為pB315B-CAG-puro-pGFP-scFv、pB315B-EF1α-puro-pGFP-scFv。通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將構(gòu)建的兩個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DF-1細胞和293T細胞,獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染抗新城疫病毒單鏈抗體的DF-1-CAG-scFv、 293T-CAG-scFv、DF-1-EF1α-scFv與293T-EF1α-scFv等4種細胞系。PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在DF-1和293T細胞中的轉(zhuǎn)座效率分別為19.1%和25.8%。RT-PCR結(jié)果表明,抗新城疫病毒單鏈抗體基因在4種細胞中均檢測到mRNA。通過western blot檢測與抗新城疫病毒單鏈抗體融合的His標簽蛋白來確定其在各細胞系中的表達情況,結(jié)果表明,在上述4種轉(zhuǎn)染細胞的裂解液中均沒有檢測到His標簽蛋白,然而在DF-1-EF1α-scFv和DF-1-CAG-scFv細胞上清中有scFv表達,前者含量高于后者。利用6倍、60倍、600倍TCID50的新城疫病毒分別感染DF-1、DF-1-CAG-scFv和DF-1-EF1α-scFv細胞。結(jié)果表明,當新城疫病毒量為60TCID50與600TCID50時,DF-1與DF-1-CAG-scFv細胞發(fā)生病變的孔數(shù)明顯多于DF-1-EF1α-scFv。本實驗表明,EF1α啟動子對單鏈抗體的表達翻譯效果更好,利用該啟動子構(gòu)建的新城疫病毒單鏈抗體能夠在DF-1細胞中穩(wěn)定表達,并分泌到細胞外,具有良好的抗新城疫病毒效果。將以EF1α為啟動子的抗新城疫病毒單鏈抗體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞原始生殖細胞(PGCs),24 h后的轉(zhuǎn)染效率為2.9%,經(jīng)嘌呤霉素篩選后得到穩(wěn)定表達抗新城疫病毒單鏈抗體的PGCs細胞系。本研究為抗新城疫病毒單鏈抗體的轉(zhuǎn)基因雞的生產(chǎn)奠定了基礎。
[Abstract]:Newcastle disease (NDV) is a kind of respiratory disease of poultry caused by Newcastle disease virus (NDV). It is highly lethal to the host, so it poses a great threat to the poultry industry in China and even the whole world. ScFvv is the smallest functional structural unit of immunoglobulin with antigen-binding activity. It can be expressed in both vertebrates and non-vertebrates. ScFv is used in medical diagnosis and treatment. In this study, PiggyBac transposon system was used to construct eukaryotic expression vector of single chain antibody against Newcastle disease virus, pB315B-CAG-puro-pGFP-scFv-pB315B-EF1 偽 -puro-pGFP-scFv.Two recombinant plasmids were transfected into DF-1 cells and 293T cells by liposome LipofectamineTM2000. Four cell lines, DF-1-CAG-scFvv, 293T-CAG-scFvv, DF-1-EF1 偽 -scFv and 293T-EF1 偽 -scFv, which were stably transfected into DF-1 and 293T cells, were obtained. The translocation efficiency of PiggyBac transposition subsystem in DF-1 and 293T cells was 19.1% and 25.8.RT-PCR, respectively. The anti-Newcastle disease virus single-chain antibody gene was detected in all four kinds of cells. The expression of mRNA in all cell lines was determined by western blot detection and His tag protein fusion with anti-Newcastle disease virus single chain antibody. No His tag protein was detected in the lytic fluid of the four transfected cells, but scFv was expressed in the supernatant of DF-1-EF1 偽 -scFv and DF-1-CAG-scFv cells. The content of the former was higher than that of the latter. Newcastle disease virus (NDV) was infected with DF-1-CAG-scFv and DF-1-EF1 偽 -scFv cells using 6 times 60 times TCID50. When Newcastle disease virus was 60 TCID50 and 600TCID50, the number of holes in DF-1 and DF-1-CAG-scFv cells was significantly higher than that in DF-1-EF1 偽 -scFv. the results showed that EF1 偽 promoter was more effective in the translation of scFv. The Newcastle disease virus single chain antibody constructed by the promoter could be stably expressed in DF-1 cells and secreted into the cells outside the cells. The single chain antibody plasmids with EF1 偽 as promoter were transfected into chicken primordial germ cells for 24 h. The transfection efficiency was 2.9%. After screening with purine mycin, stable expression of anti-Newcastle disease virus was obtained. This study laid a foundation for the production of transgenic chicken against Newcastle disease virus single chain antibody (scFv).
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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