本文選題：奶山羊　切入點：子宮內膜上皮細胞　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：本研究以奶山羊子宮內膜上皮細胞(EEC)為研究對象,構建雙熒光素酶報告載體驗證miR-182與NTS和TES的靶向關系,用Real-time PCR、Western Blot等方法研究miR-182對基因NTS、TES和Caspase-8、p38表達量的影響。構建pcDNA3.1(+)過表達載體,研究NTS和TES的相互作用、對Caspase-8和p38蛋白表達量以及對子宮內膜上皮細胞凋亡的影響。主要研究結果如下:1.驗證mi R-182與NTS和TES的靶向調節(jié)關系生物信息學預測發(fā)現(xiàn)奶山羊NTS基因3'UTR存在mi R-182靶位點,TES基因CDS區(qū)存在miR-182靶位點。構建雙熒光素酶報告載體,分別與miR-182模擬物、Negative control(NC)共轉染到293T細胞中。結果表明,與對照組NC相比,miR-182模擬物顯著抑制了熒光素酶活性,表明miR-182通過與NTS-3'UTR相互作用導致熒光素酶活性降低(P0.05),與TES基因CDS區(qū)相互作用導致熒光素酶活性降低(P0.05)。據(jù)此,本研究初步鑒定NTS和TES為miR-182的靶基因。2.驗證mi R-182對NTS、TES、Caspase-8、p38表達量的影響采用Real-time PCR和Western Blot技術檢測NTS和TES基因的表達水平。結果表明,與對照組相比,miR-182在mRNA和蛋白水平均顯著抑制靶基因NTS和TES的表達(P0.05)。采用Western Blot技術發(fā)現(xiàn)mi R-182顯著增加了Caspase-8的蛋白表達量(P0.05),減少了p38的蛋白表達量(P0.05)。3.檢測NTS和TES對Caspase-8、p38表達量的影響構建pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES過表達載體并轉染EEC,采用Western Blot技術檢測Caspase-8和p38表達量,并與對照組相比。結果顯示過表達NTS和TES顯著降低了Caspase-8蛋白表達量(P0.05),增加了p38的蛋白表達量(P0.05)。這一結果與miR-182對Caspase-8、p38表達量的影響結果相反。4.驗證NTS和TES的相互作用和對EEC凋亡的影響將pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES過表達載體轉染EEC,通過Real-time PCR和Western Blot技術檢測NTS和TES基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)過表達NTS顯著抑制了TES mRNA和蛋白水平表達量(P0.05)。而過表達TES基因只減少了NTS蛋白的表達量(P0.05),對NTS mRNA沒有顯著影響(P0.05)。用流式細胞儀檢測pcDNA3.1(+)-NTS和pcDNA3.1(+)-TES對EEC凋亡的影響,結果表明NTS和TES均顯著抑制了EEC凋亡(P0.05)。以上結果表明,NTS和TES為miR-182的靶基因,mi R-182可能通過下調NTS和TES,上調Caspase-8而影響奶山羊子宮內膜上皮細胞的凋亡。
[Abstract]:In this study, a double luciferase report vector was constructed to study the targeting relationship between miR-182 and NTS and TES in dairy goat endometrial epithelial cells (EECs). The effect of miR-182 on the expression of NTSnTES and Caspase-8 p38 was studied by Real-time PCR Western Blot. PcDNA3.1 () overexpression vector was constructed to study the interaction between NTS and TES. The main results are as follows: 1. To verify the targeted regulatory relationship between miR-182 and NTS and TES. Bioinformatics prediction found that the 3UTR of NTS gene of dairy goats exists mi R-182. There is a miR-182 target site in the CDS region of the tes gene. A double luciferase reporter vector was constructed. The results showed that the mimics of nmmiR-182 significantly inhibited luciferase activity in 293T cells compared with the control group (NC). The results showed that the activity of luciferase decreased by interaction of miR-182 with NTS-3'UTR, and the activity of luciferase decreased by interaction with CDS region of TES gene. In this study, NTS and TES were identified as target genes of miR-182. The effect of miR-182 on the expression of Caspase-8 p38 was detected by Real-time PCR and Western Blot techniques. Compared with the control group, pmiR-182 significantly inhibited the expression of target gene NTS and TES at both mRNA and protein levels. Using Western Blot technique, it was found that miR-182 significantly increased the protein expression of Caspase-8 and decreased the protein expression of p38. Detection of NTS and TES on Caspase-8p38 was carried out. PcDNA3.1 (Western Blot technique was used to detect the expression of Caspase-8 and p38). The results showed that overexpression of NTS and TES significantly decreased the expression of Caspase-8 protein, increased the expression of p38 protein and increased the expression of p38 protein. This result was contrary to the effect of miR-182 on the expression of Caspase-8 p38. 4. The interaction between NTS and TES was verified. Real-time PCR and Western Blot were used to detect the expression level of NTS and TES genes. The results showed that overexpression of NTS significantly inhibited the expression of TES mRNA and protein levels (P0.05). The expression of TES gene only reduced the expression of NTS protein (P0.05), but had no significant effect on NTS mRNA. Flow cytometry was used to detect the effect of pcDNA3.1 (pnts) and pcDNA3.1 (P0.05) on the apoptosis of EEC. The results showed that both NTS and TES inhibited EEC apoptosis significantly (P 0.05). The results indicated that the target genes of miR-182, TES and TES, might affect the apoptosis of endometrial epithelial cells of dairy goats by down-regulating NTS and tes and up-regulating Caspase-8.
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S827

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本文編號：1567601