本文關(guān)鍵詞： PCV2 分離鑒定 感染性克隆 病毒拯救 小鼠模型　出處：《吉林大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬圓環(huán)病毒�。≒orcine circovirus diseases）是由豬圓環(huán)病毒2型引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的新發(fā)傳染病，以斷奶仔豬生長發(fā)育不良、消瘦、呼吸困難、皮下淋巴結(jié)高度腫大、出血和壞死，母豬繁殖障礙為主要特征。本研究應(yīng)用PCR擴增病毒基因組序列和免疫學(xué)等技術(shù)方法確診長春市某規(guī)�；B(yǎng)豬場暴發(fā)的一起斷奶仔豬病因未明疫病為豬圓環(huán)病毒2型感染，并應(yīng)用病毒分離技術(shù)獲得一株豬圓環(huán)病毒2型毒株，命名為PCV2CC12毒株。 序列測定與比對分析發(fā)現(xiàn)CC12毒株的基因組存在獨特的突變。與目前已知PCV2毒株相比，CC12毒株基因組第607位核苷酸由腺嘌呤（A）突變?yōu)轼B嘌呤（G），該突變導(dǎo)致所編碼的Rep蛋白第186位氨基酸由天冬酰胺（N）突變?yōu)榻z氨酸（S）。此外，，CC12毒株編碼的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白Cap亦存在兩個少見突變，包括59位氨基酸由精氨酸（R）突變?yōu)橘嚢彼幔↘），190位氨基酸由丙氨酸（A）突變?yōu)樘K氨酸（T）。核苷酸和氨基酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)CC12毒株與目前國內(nèi)豬群流行的毒株相似，屬于PCV2b基因型。該結(jié)果為防控該病提供了流行病學(xué)理論依據(jù)。 根據(jù)CC12毒株的完整基因組序列，設(shè)計合成引物，以PCR擴增病毒的全基因組序列，并將其插入pBluescript II SK載體構(gòu)建獲得CC12株單拷貝基因組重組質(zhì)粒，并以此構(gòu)建了正向雙拷貝重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的感染性克隆以脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后，經(jīng)過連續(xù)盲傳8代后，應(yīng)用PCR方法、間接免疫熒光技術(shù)（IFA）、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗（IPMA）和免疫印跡技術(shù)（Westernblot）檢測到病毒核酸分子和病毒Cap結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)，表明CC12毒株拯救成功。我們將拯救的CC12毒株命名為rCC12。rCC12與親本病毒具有相似的TCID50病毒滴度和生物學(xué)特性。該結(jié)果為研究PCV2復(fù)制機理、致病機制及病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用提供了有效的工具和平臺。 將CC12病毒通過腹腔注射途徑接種昆明小鼠，通過檢測不同時間病毒在體內(nèi)的分布及其引起的病理損傷與誘導(dǎo)的抗體水平，建立病毒感染小鼠模型。免疫組織化學(xué)檢測PCV2病毒抗原的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠感染初期病毒主要分布于肝臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)、心臟、肺臟和胸腺；而感染35天后，PCV2主要集中在淋巴結(jié)，這與PCR檢測結(jié)果基本一致；組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，感染小鼠肺臟、肝臟、胸腺、淋巴結(jié)、脾臟均出現(xiàn)程度不一的炎性病變或壞死；ELISA檢測抗體結(jié)果顯示，小鼠接種PCV2后第7天可以檢測到抗體，第28天抗體水平達(dá)到最高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。
[Abstract]:Porcine circovirus disease (Porcine circovirus disease) is a new infectious disease caused by porcine circovirus type 2, which seriously endangers the development of pig industry. It is characterized by poor growth, wasting, dyspnea, high swelling of subcutaneous lymph nodes, hemorrhage and necrosis in weaned piglets. In this study, PCR amplification virus genomic sequence and immunology were used to confirm that an outbreak of weaning piglets caused by an outbreak in a large scale pig farm in Changchun was due to the infection of porcine circovirus type 2. A porcine circovirus type 2 strain, named PCV2CC12 strain, was obtained by virus isolation technique. Sequence determination and alignment analysis showed that there was a unique mutation in the genome of the CC12 strain. Compared with the known PCV2 strain, the 607 nucleotide mutation in the genome of the CC12 strain was transformed from adenine to guanine guanine, which resulted in the coding of. The 186th amino acid of Rep protein was mutated from asparagine to serine, and there were two rare mutations in capsid structure protein Cap encoded by CC12 strain. The amino acids of 59 amino acids were mutated from arginine R) to lysine kapok (190 amino acids from alanine A) to threonine tassel. The comparison of nucleotide and amino acid sequences showed that the CC12 strains were similar to those prevalent in swine populations in China. The results provide an epidemiological basis for the prevention and control of the disease. According to the complete genome sequence of CC12 strain, the primers were designed and synthesized, the whole genome sequence of the virus was amplified by PCR, and inserted into pBluescript II SK vector to construct the single copy genome recombinant plasmid of CC12 strain. The positive double copy recombinant plasmid was constructed. The constructed infectious clone was transfected into PK15 cells by liposome mediated method. After 8 consecutive generations of blind transmission, PCR method was used. The expression of viral nucleic acid molecules and viral Cap structural proteins was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA), immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) and Western blot (Western blot). The results showed that the CC12 strain was successfully saved. We named the rescued CC12 strain rCC12.rCC12 having similar titers and biological characteristics of TCID50 virus to parent virus. This result was used to study the replication mechanism of PCV2. The pathogenicity mechanism and the interaction between virus and host cells provide an effective tool and platform. The CC12 virus was inoculated into Kunming mice by intraperitoneal injection. The distribution of the virus in the body, the pathological damage caused by the virus and the induced antibody level were detected by measuring the distribution of the virus in the body at different time points. The PCV2 virus antigen was detected by immunohistochemistry. The results showed that the virus mainly distributed in liver, kidney, spleen, lymph node, heart, lung and thymus. After 35 days of infection, PCV2 was mainly concentrated in lymph nodes, which was consistent with the results of PCR. Histopathological observation showed that the infected mice were infected with lung, liver, thymus and lymph nodes. The results of Elisa showed that antibodies could be detected on the 7th day after inoculation of PCV2, reached the highest level on the 28th day, and then showed a downward trend.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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