本文關鍵詞： 牛 體外成熟 BMP15 GDF9 卵丘細胞 細胞凋亡　出處：《中國農業(yè)科學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：體外成熟(IVM)、體外受精(IVF)和胚胎培養(yǎng)(IVF)等技術是體外生產家畜、實驗動物甚至野生動物胚胎的有效技術方法,是提高家畜繁殖性能的重要技術途徑,因此,全世界許多研究人員開展了多種動物體外胚胎技術研究,體外胚胎生產效率不斷提高。卵母細胞IVM時卵母細胞質量與發(fā)育能力是決定體外生產胚胎(IVP)效率的重要因素。體外實驗表明,卵母細胞發(fā)育與其周圍包裹得顆粒細胞之間相互影響,不同動物如小鼠、羊和豬的顆粒細胞(CCs)都對其卵母細胞發(fā)育能力具有重要意義,而卵母細胞分泌因子如生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)與CCs細胞凋亡息息相關,進而影響卵母細胞自身質量和受精后胚胎的發(fā)育。IVM時培養(yǎng)液中添加一定濃度的外源性BMP15和GDF9,CCs中細胞凋亡顯著下降,因此,GDF9和BMP15可能是卵母細胞體外成熟過程中調節(jié)CCs細胞凋亡的重要因素。然而,不同動物中BMP15和GDF9調節(jié)CCs凋亡的機理可能不盡相同。因此,本論文研究牛體外成熟卵母細胞分泌因子BMP15和GDF9的表達,添加外源BMP15和GDF9對CCs相關促凋亡和抗凋亡基因表達的影響,以及外源GDF9調控CCs凋亡的可能信號通路。本論文包括三個實驗:(1)體外培養(yǎng)牛卵母細胞BMP15和GDF9基因表達的研究。分別研究不同培養(yǎng)時間0h(GV)、16h(MII)、24h(MII)BMP15和GDF9基因m RNA的表達;(2)體外添加外源BMP15和GDF9對體外培養(yǎng)牛卵母細胞顆粒細胞CCs凋亡影響的研究。培養(yǎng)液中分別添加BMP15和GDF9的濃度為0BMP15+GDF9(對照組);100ng/m L BMP15;100ng/m L GDF9;100ng/m L BMP15+100ng/m L GDF9。培養(yǎng)24h后,定量RT-PCR分析CCs細胞中促凋亡基因(Bim、Bax、p53),和抗凋亡基因(Bcl2)m RNA的表達,Western Blot檢測Bim和p53蛋白的表達;(3)GDF9調控CCs凋亡通路的研究。培養(yǎng)液中添加100ng/ml的GDF9,分別添加抑制劑SB203580、PDTC、SB431542或者LY294002作用1h后,Western Blot檢測Bim蛋白表達。實驗結果表明:(1)IVM期間BMP15和GDF9 m RNA在牛卵母細胞中表達,并在16h(MII)達到最大;(2)外源性GDF9能顯著降低Bim m RNA和蛋白在牛卵丘細胞中的表達(3)GDF9可能通過SMAD、PI3K途徑降低Bim的表達。
[Abstract]:In vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and embryo culture (IVF) technology is a effective technique of in vitro production of livestock, animal and even wild animal embryos, is an important approach to improve the reproductive performance of livestock, so many researchers around the world to carry out a variety of animal embryos in vitro embryo production in vitro continuously improve the efficiency of oocytes. IVM oocyte quality and developmental ability is determined in vitro embryo production (IVP) is an important factor of efficiency. In vitro experiments showed that oocytes and granulosa cells in vitro wrapped around to each other between different animal, such as mice, sheep and pig granulosa cells (CCs) has important significance the development ability of the oocytes and oocyte secreted factors such as growth differentiation factor 9 (GDF9) and bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and CCs cell apoptosis closely, thereby affecting the oocytes The cell quality itself and after fertilization of the embryo development of.IVM culture medium added with a certain concentration of exogenous BMP15 and GDF9, apoptosis of CCs cells decreased significantly, therefore, GDF9 and BMP15 may be an important factor in regulating the apoptosis of CCs cells during oocyte maturation in vitro. However, the mechanism of BMP15 and GDF9 in regulating the apoptosis of CCs in different the animal may not be the same. Therefore, the expression of bovine oocytes matured in vitro secreted BMP15 and GDF9, the effects of exogenous BMP15 and GDF9 on the expression of CCs related apoptosis and anti apoptosis gene, and exogenous GDF9 regulation CCs apoptosis signal pathway. This paper consists of three experiments: (1 study on the expression of bovine oocytes) BMP15 and GDF9 gene in vitro. Studies of different culture time 0h (GV), 16h (MII), 24h (MII) expression of BMP15 and GDF9 gene m RNA; (2) in vitro with exogenous BMP15 and GDF9 on in vitro Study on the apoptosis of cattle oocyte granulosa cells CCs. BMP15 and GDF9 concentration were added to the solution of 0BMP15+GDF9 (control group); 100ng/m L BMP15; 100ng/m L GDF9; 100ng/m L BMP15+100ng/m L GDF9. 24h after culture, quantitative analysis of RT-PCR in CCs cells apoptosis genes (Bim, Bax, p53). And the anti apoptotic gene (Bcl2) expression of M RNA, the expression of Western Blot detection of Bim and p53 protein; (3) the regulatory role of GDF9 on CCs apoptosis pathway. GDF9 100ng/ml added in liquid culture, adding inhibitor SB203580, PDTC, SB431542 or LY294002 1H, to detect the expression of Bim protein Western Blot. The experimental results show that: (1) the expression of IVM BMP15 and GDF9 m during RNA in bovine oocytes, and in 16h (MII) reached the maximum; (2) exogenous GDF9 can significantly reduce the Bim m and RNA protein in bovine cumulus cells the expression of GDF9 (3) by SMAD, PI3K pathway decreased Bim table Da.

【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S823

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本文編號：1547142