本文關(guān)鍵詞： 捻轉(zhuǎn)血矛線 Hco-gal-m/f TMEM63A 細(xì)胞功能　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)是牛羊等反芻動(dòng)物重要的腸道寄生性線蟲(chóng)。它寄生在牛羊等宿主動(dòng)物真胃及小腸內(nèi),靠吸食宿主血液為生。感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)能夠引起宿主免疫功能低下,造成宿主貧血、消瘦及死亡,死亡多發(fā)生于羔羊。給世界范圍內(nèi)畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。Hco-gal-m(Acc.No.AY253330)和 Hco-gal-f(Acc.No.AY253331)是由本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn),分離,體外克隆表達(dá)的,分別來(lái)自于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)的半乳糖結(jié)合凝集素。本實(shí)驗(yàn)室目前研究表明,重組Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)能夠以劑量依賴(lài)方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞遷移能力,n少氧自由基釋放,降低NO產(chǎn)量和細(xì)胞因子水平。當(dāng)用rHco-gal-m/f免疫山羊時(shí),會(huì)出現(xiàn)糞便內(nèi)蟲(chóng)卵量降低,山羊體內(nèi)蟲(chóng)體減少,IgG水平上升等變化。而跨膜蛋白63A(TMEM63A)是Ⅳ型跨膜蛋白。進(jìn)一步研究證明,TMEM63A在大多數(shù)山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞上表達(dá),參與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。然而,目前TMEM63A只在為數(shù)不多的幾種哺乳動(dòng)物上發(fā)現(xiàn),其功能均未知。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 TMEM63A是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)半乳糖結(jié)合凝集素在山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞上的受體或結(jié)合蛋白。本文使用抗體封閉技術(shù)、RNA干擾技術(shù)研究TMEM63A對(duì)Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs(單核細(xì)胞)增殖、遷移、吞噬以及NO分泌功能的影響。1.TMEM63A-Ⅰ原核克隆表達(dá)由于TMEM63A是一個(gè)多次跨膜蛋白,且疏水性較強(qiáng),不能以整體的形式在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。我們選擇TMEM63A最長(zhǎng)膜內(nèi)區(qū)片段TMEM63A-Ⅰ作為目的片段進(jìn)行克隆表達(dá)。TMEM63A-Ⅰ全長(zhǎng)648bp。對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)信息分析,發(fā)現(xiàn)此片段疏水性較弱,有B細(xì)胞作用位點(diǎn)。首先將TMEM63A-Ⅰ重組進(jìn)入pMD18-T載體,用以TMEM63A-Ⅰ基因片段保存。經(jīng)測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)載體中TMEM63A-Ⅰ基因片段與NCBI中該片段同源性達(dá)100%。隨后,構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-TMEM63A-Ⅰ,并將其轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21,構(gòu)建表達(dá)菌株BL21-pET-28a-TMEM63A-Ⅰ。用IPTG誘導(dǎo)5h,收集菌液。SDS-PAGE分析顯示,表達(dá)蛋白25KD大小,存在于包涵體中。用鎳柱純化蛋白。2.多克隆抗體制備用腸激酶切去純化后蛋白上的載體標(biāo)簽,收集無(wú)標(biāo)簽純化蛋白,測(cè)濃度后分裝保存。用無(wú)標(biāo)簽純化蛋白與弗氏佐劑混成乳濁液,多次免疫大鼠。收集免疫大鼠血清,用飽和硫酸銨純化法純化多克隆抗體anti-63-IP。用免疫共沉淀方法驗(yàn)證多克隆抗體anti-63-IP的特異性。Western blot結(jié)果顯示,anti-63-IP能夠特異性識(shí)別天然構(gòu)象TMEM63A。用間接ELISA方法檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)。3.TMEM63A在Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs功能中的影響抗體封閉技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單獨(dú)用40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs(或單核細(xì)胞)共孵育,同單獨(dú)細(xì)胞對(duì)照組相比,PBMCs(或單核細(xì)胞)的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力被抑制。說(shuō)明Hco-gal-m/f可以抑制PBMCs(或單核細(xì)胞)的增殖能力、NO分泌能力和遷移能力。用濃度為2ug/mL的TMEM63A特異性抗體anti-63AIgG和 40μg/mLHco-gal-m/f 與 PBMCs(或單核細(xì)胞)共孵育,同用 40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比,PBMCs(或單核細(xì)胞)的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力明顯提高,但與單獨(dú)細(xì)胞對(duì)照組相比,PBMCs(或單核細(xì)胞)的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力變化不明顯。用濃度為2ug/mL的非特性性抗體Neg A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與細(xì)胞共孵育,同40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比,細(xì)胞增殖能力、吞噬能力、NO分泌能力、遷移能力無(wú)顯著改變。說(shuō)明特異性抗體anti-63AIgG可以阻斷Hco-gal-m/f與受體TMEM63A的結(jié)合,進(jìn)而阻斷Hco-gal-m/f對(duì)細(xì)胞功能的影響。RNA干擾技術(shù)研究結(jié)果顯示,用特異性TMEM63A干擾RNA TMEM63A-siRNA-1處理細(xì)胞后與40μg/mLHco-gal-m/f共孵育,細(xì)胞增殖能力、NO分泌能力、遷移能力的變化趨勢(shì)與抗體處理趨勢(shì)相一致,但差異不顯著。上述結(jié)果表明,細(xì)胞TMEM63A是Hco-gal-m/f的受體或結(jié)合蛋白,對(duì)Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)細(xì)胞功能具有重要影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S858.27

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1546652