本文關(guān)鍵詞： 捻轉(zhuǎn)血矛線 Hco-gal-m/f TMEM63A 細胞功能　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是牛羊等反芻動物重要的腸道寄生性線蟲。它寄生在牛羊等宿主動物真胃及小腸內(nèi),靠吸食宿主血液為生。感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲能夠引起宿主免疫功能低下,造成宿主貧血、消瘦及死亡,死亡多發(fā)生于羔羊。給世界范圍內(nèi)畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。Hco-gal-m(Acc.No.AY253330)和 Hco-gal-f(Acc.No.AY253331)是由本實驗室首次發(fā)現(xiàn),分離,體外克隆表達的,分別來自于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌蟲和雄蟲的半乳糖結(jié)合凝集素。本實驗室目前研究表明,重組Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)能夠以劑量依賴方式誘導(dǎo)細胞凋亡,降低細胞遷移能力,n少氧自由基釋放,降低NO產(chǎn)量和細胞因子水平。當用rHco-gal-m/f免疫山羊時,會出現(xiàn)糞便內(nèi)蟲卵量降低,山羊體內(nèi)蟲體減少,IgG水平上升等變化。而跨膜蛋白63A(TMEM63A)是Ⅳ型跨膜蛋白。進一步研究證明,TMEM63A在大多數(shù)山羊外周血單個核細胞上表達,參與細胞因子調(diào)節(jié)。然而,目前TMEM63A只在為數(shù)不多的幾種哺乳動物上發(fā)現(xiàn),其功能均未知。本實驗室通過大量實驗證實了 TMEM63A是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素在山羊外周血單個核細胞上的受體或結(jié)合蛋白。本文使用抗體封閉技術(shù)、RNA干擾技術(shù)研究TMEM63A對Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs(單核細胞)增殖、遷移、吞噬以及NO分泌功能的影響。1.TMEM63A-Ⅰ原核克隆表達由于TMEM63A是一個多次跨膜蛋白,且疏水性較強,不能以整體的形式在原核表達系統(tǒng)中表達。我們選擇TMEM63A最長膜內(nèi)區(qū)片段TMEM63A-Ⅰ作為目的片段進行克隆表達。TMEM63A-Ⅰ全長648bp。對其進行生物學(xué)信息分析,發(fā)現(xiàn)此片段疏水性較弱,有B細胞作用位點。首先將TMEM63A-Ⅰ重組進入pMD18-T載體,用以TMEM63A-Ⅰ基因片段保存。經(jīng)測序分析,發(fā)現(xiàn)載體中TMEM63A-Ⅰ基因片段與NCBI中該片段同源性達100%。隨后,構(gòu)建表達載體pET-28a-TMEM63A-Ⅰ,并將其轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21,構(gòu)建表達菌株BL21-pET-28a-TMEM63A-Ⅰ。用IPTG誘導(dǎo)5h,收集菌液。SDS-PAGE分析顯示,表達蛋白25KD大小,存在于包涵體中。用鎳柱純化蛋白。2.多克隆抗體制備用腸激酶切去純化后蛋白上的載體標簽,收集無標簽純化蛋白,測濃度后分裝保存。用無標簽純化蛋白與弗氏佐劑混成乳濁液,多次免疫大鼠。收集免疫大鼠血清,用飽和硫酸銨純化法純化多克隆抗體anti-63-IP。用免疫共沉淀方法驗證多克隆抗體anti-63-IP的特異性。Western blot結(jié)果顯示,anti-63-IP能夠特異性識別天然構(gòu)象TMEM63A。用間接ELISA方法檢測多克隆抗體效價。3.TMEM63A在Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs功能中的影響抗體封閉技術(shù)實驗結(jié)果顯示,單獨用40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs(或單核細胞)共孵育,同單獨細胞對照組相比,PBMCs(或單核細胞)的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力被抑制。說明Hco-gal-m/f可以抑制PBMCs(或單核細胞)的增殖能力、NO分泌能力和遷移能力。用濃度為2ug/mL的TMEM63A特異性抗體anti-63AIgG和 40μg/mLHco-gal-m/f 與 PBMCs(或單核細胞)共孵育,同用 40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比,PBMCs(或單核細胞)的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力明顯提高,但與單獨細胞對照組相比,PBMCs(或單核細胞)的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力變化不明顯。用濃度為2ug/mL的非特性性抗體Neg A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與細胞共孵育,同40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比,細胞增殖能力、吞噬能力、NO分泌能力、遷移能力無顯著改變。說明特異性抗體anti-63AIgG可以阻斷Hco-gal-m/f與受體TMEM63A的結(jié)合,進而阻斷Hco-gal-m/f對細胞功能的影響。RNA干擾技術(shù)研究結(jié)果顯示,用特異性TMEM63A干擾RNA TMEM63A-siRNA-1處理細胞后與40μg/mLHco-gal-m/f共孵育,細胞增殖能力、NO分泌能力、遷移能力的變化趨勢與抗體處理趨勢相一致,但差異不顯著。上述結(jié)果表明,細胞TMEM63A是Hco-gal-m/f的受體或結(jié)合蛋白,對Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)細胞功能具有重要影響。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.27

【參考文獻】

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本文編號：1546652