本文關(guān)鍵詞： ACAA2 CRISPR/Cas9 前體脂肪細(xì)胞　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：脂肪組織是一個具備能量儲存和分泌激素功能的內(nèi)分泌器官,脂肪組織如果過度生長和發(fā)育,即體脂過度沉積在引起人類肥胖癥狀發(fā)生的同時也會引發(fā)諸如糖尿病、脂肪肝、膽囊疾病、高血壓、內(nèi)分泌紊亂等相關(guān)疾病,在畜牧業(yè)生產(chǎn)上可以降低動物胴體的瘦肉率,會對肉品質(zhì)造成一定的影響。前體脂肪細(xì)胞是具有增殖和向脂肪細(xì)胞分化能力的特異化細(xì)胞,體脂沉積是前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的結(jié)果,因此,研究前體脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)理能夠?yàn)榭刂企w脂沉積提供理論基礎(chǔ),為家畜育種和動物生產(chǎn)提供參考。ACAA2(acetyl-Coenzyme A acyltransferase2)是脂肪酸氧化步驟中的關(guān)鍵酶,它催化脂肪酸β的氧化。研究表明,ACAA2是參與脂類代謝通路的關(guān)鍵基因,在pathway中占據(jù)節(jié)點(diǎn)位置,初步確立該基因?yàn)橛绊懼惔x的關(guān)鍵基因。前人都基于在分子水平上對ACAA2的多態(tài)性進(jìn)行研究,關(guān)于ACAA2在調(diào)控前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程的機(jī)制研究的還不是很清楚,為了探索其在細(xì)胞分化過程中的作用,本研究以ACCA2為研究對象,以分離的綿羊原代前體脂肪細(xì)胞為研究媒介,應(yīng)用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除與基因過量表達(dá)技術(shù),探討ACAA2在調(diào)控綿羊前體脂肪細(xì)胞分化中的作用。主要研究內(nèi)容如下:1.通過體外PCR擴(kuò)增ACAA2的編碼區(qū),瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶大小與預(yù)期一致,測序結(jié)果NCBI上與綿羊比對同源性為100%。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:綿羊ACAA2共編碼397個氨基酸,理論等電點(diǎn)為5.06,是一種酸性蛋白,該蛋白為疏水性蛋白。ACAA2蛋白沒有信號肽,該蛋白含有4個磷酸化位點(diǎn),4個N-糖基化位點(diǎn),10個O-糖基化位點(diǎn)。該蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有15個α螺旋(Alpha helix),27個β折疊(Beta turn),18個Turn轉(zhuǎn)角,16個Coil卷曲螺旋。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示綿羊ACAA2蛋白與山羊進(jìn)化關(guān)系密切。2.ACAA 敲除載體及過表達(dá)載體構(gòu)建及活性驗(yàn)證:目的基因連接pcDNA3.1過表達(dá)載體后用EcoR I和Kpn I進(jìn)行雙酶切獲得ACAA2目的條帶,連接產(chǎn)物測序結(jié)果表明ACAA2-pcDNA3.1過表達(dá)載體構(gòu)建成功。設(shè)計(jì)3個gRNA靶位點(diǎn),Cas9體外酶切檢測靶點(diǎn)的效率,酶切活性分別為60%、73%、75%,選取活性最高的gRNA5靶點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)源活性驗(yàn)證,結(jié)果表明突變型基因組成功被T7E1酶剪切出740bp和454bp兩條條帶,顯示該靶點(diǎn)具有兼具外源和內(nèi)源活性,符合后期實(shí)驗(yàn)要求。將活性最高的ACAA2-Cas9/gRNA敲除載體轉(zhuǎn)染綿羊耳樣成纖維細(xì)胞,當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量與脂質(zhì)體體積比分別為1:1、1:2.5、1:3時轉(zhuǎn)染效率分別為30%、50%、75%,確定最佳轉(zhuǎn)染條件為1:3。3.ACAA2敲除和過表達(dá)影響前體脂肪細(xì)胞分化的研究:采集3月齡羊尾部、皮下脂肪組織,獲得的較高純度的前體脂肪細(xì)胞的生長曲線呈“S”型,基本符合體外前體脂肪細(xì)胞的生長增值規(guī)律。前體脂肪細(xì)胞經(jīng)過INS+DEX+IBMX誘導(dǎo)分化后,胞內(nèi)脂滴數(shù)量增多,并出現(xiàn)標(biāo)志性的“脂環(huán)”。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞被油紅O染成橘紅色,前體脂肪細(xì)胞成功被誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞。將ACAA5-gRNA5、ACAA2-pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染綿羊前體脂肪細(xì)胞48h后誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo),經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn),ACAA5-gRNA5轉(zhuǎn)染組誘導(dǎo)6d和10d后,脂滴數(shù)量明顯低于對照組,ACAA2-pcDNA3.1組誘導(dǎo)6d和10d后,脂滴數(shù)量明顯增加。對照組、ACAA2-gRNA組、ACAA2-pcDNA3.1組PPARγ的表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.42±0..12、1.5士0.27;LPL 的表達(dá)量為 1.00±0.10、0.37±0.15、1.47±0.16;AP2的表達(dá)量為1.00±0.06、0.30±0.10,1.32±0.08,敲除組基因的表達(dá)量與對照組相比均顯著下調(diào),過表達(dá)組基因的表達(dá)量與對照組相比均顯著上調(diào)。說明敲除ACAA2,抑制脂滴形成,抑制前體脂肪細(xì)胞分化;過表達(dá)ACAA2,促進(jìn)脂滴形成,促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化。
[Abstract]:ACAA is a key gene involved in lipid metabolism . The results show that ACAA2 is a key gene involved in the differentiation of fat cells . The results show that ACAA2 is a key gene involved in the differentiation of fat cells . The results showed that the growth curve of the preadipocytes was 1 鈭，

本文編號：1538696