本文關(guān)鍵詞： 豬圓環(huán)病毒2型 生物信息學(xué) 遺傳標(biāo)記 感染性克隆 iDNA疫苗　出處：《貴州大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是無(wú)囊膜單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒,基因組大小約為1.8kb,屬于圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬。PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原體,可以引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD),其主要癥狀表現(xiàn)為皮膚蒼白、消瘦、腹瀉、呼吸障礙、黃疸等癥狀,發(fā)病豬群死亡率高和繁殖障礙等,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫接種是防控PCV2感染的有效手段,有關(guān)PCV2疫苗的研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注熱點(diǎn)。由于近些年來(lái)提出的i DNA疫苗具有多項(xiàng)傳統(tǒng)疫苗無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),該類(lèi)疫苗為應(yīng)用感染性克隆技術(shù)構(gòu)建的新型核酸疫苗,在機(jī)體內(nèi)能夠發(fā)揮弱毒疫苗和核酸疫苗的雙重免疫效果,具有較好的研發(fā)前景。本研究應(yīng)用i DNA疫苗技術(shù)構(gòu)建了一種攜帶遺傳標(biāo)記的PCV2新型感染性克隆,并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了初步研究,初步驗(yàn)證了PCV2 iDNA新型標(biāo)記疫苗構(gòu)建策略的正確性,為研究開(kāi)發(fā)PCV2 iDNA標(biāo)記疫苗奠定了前期基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下:1、豬圓環(huán)病毒2型GZ-RH1株全基因組遺傳特征分析為掌握PCV2 Cap蛋白末端具有賴(lài)氨酸延伸特征的GZ-RH1株(JQ809464)的全基因組遺傳特征和后續(xù)研究提供科學(xué)參考,應(yīng)用生物信息學(xué)的方法和工具對(duì)其基因的結(jié)構(gòu)和功能、編碼蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及密碼子偏好性等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。全基因組核苷酸序列分析表明該毒株與先前報(bào)道的含有11個(gè)ORF框的PCV2毒株(AF027217)相比,ORF8和ORF11缺失,ORF5和ORF10終止密碼子提前,其它ORFs則相對(duì)較為保守。推導(dǎo)蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果表明:PCV2 GZ-RH1各編碼蛋白中除ORF4和ORF9外,其它蛋白均是親水性蛋白,且僅ORF9編碼的蛋白存在信號(hào)肽序列;ORF1和ORF2編碼蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)與疫苗毒株相比,ORF1較為保守,ORF2則差異較大。編碼主要蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示,均為混合型蛋白;ORF1、2、3編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能基序分析顯示,除都具有自身蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域外,還預(yù)測(cè)到一些可能具有特殊功能的結(jié)構(gòu)域,如ORF1編碼蛋白的NACHT結(jié)構(gòu)域ORF2編碼蛋白的精氨酸富集區(qū);ORF2編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,其和疫苗毒株結(jié)構(gòu)具有較高的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,PCV2 GZ-RH1毒株屬于PCV2b亞型。ORF2編碼蛋白氨基酸位點(diǎn)熵值結(jié)果顯示,氨基酸變異較大,且含有兩個(gè)高變區(qū),分別位于第53~91位和185~215位。ORF2基因密碼子偏愛(ài)性分析顯示,昆蟲(chóng)細(xì)胞與其密碼子偏愛(ài)性較為接近,更適合其體外表達(dá)。2、攜帶遺傳標(biāo)記的PCV2感染性克隆的構(gòu)建及iDNA疫苗的初步研究為構(gòu)建獲得攜帶遺傳標(biāo)記的豬圓環(huán)病毒2型感染性克隆質(zhì)粒(iDNA),并對(duì)其進(jìn)行PCV2 iDNA疫苗的初步研究,實(shí)驗(yàn)以Cap蛋白末端具有賴(lài)氨酸延伸特征的PCV2 GZ-RH1株為材料,構(gòu)建了該毒株的感染性克隆質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-PCV2,并在病毒基因組中引入一個(gè)SalⅠ酶切位點(diǎn)作為鑒別拯救病毒的遺傳標(biāo)記。將該感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15傳代細(xì)胞后,拯救獲得的PCV2標(biāo)記毒株,經(jīng)盲傳10代后毒價(jià)可到105.3TCID50/mL,引入的遺傳標(biāo)記能夠穩(wěn)定存在。為進(jìn)一步評(píng)估該P(yáng)CV2 i DNA候選標(biāo)記疫苗在昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)特性,將20只小鼠隨機(jī)分為4組,實(shí)驗(yàn)Ⅰ組肌肉注射100μg PCV2 iDNA候選標(biāo)記疫苗(質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-PCV2),實(shí)驗(yàn)Ⅱ組肌肉注射0.1mL拯救病毒PCV2-RV(104TCID50/mL),實(shí)驗(yàn)III組肌肉注射100μg pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒陰性對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)Ⅳ組肌肉注射0.1mL MEM營(yíng)養(yǎng)液陰性對(duì)照組,而后分別于接種后7、14、21、28、35、42d小鼠斷尾采血,檢測(cè)PCV2特異性抗體水平和病毒血癥持續(xù)時(shí)間。結(jié)果顯示,接種PCV2 iDNA候選標(biāo)記疫苗和其體外拯救病毒的小鼠特異性抗體水平明顯高于對(duì)照組,接種后7d即可檢測(cè)出PCV2陽(yáng)性抗體且至少可維持42d;經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí),PCV2 i DNA候選標(biāo)記疫苗和其體外拯救病毒均能夠在小鼠體內(nèi)增殖,導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生病毒血癥的持續(xù)時(shí)間約28d。上述研究結(jié)果表明,本研究所提出的PCV2 iDNA新型標(biāo)記疫苗的構(gòu)建策略是可行的,并為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)PCV2 i DNA新型標(biāo)記疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1538574