本文關(guān)鍵詞： 黃曲霉毒素總量檢測(cè) 人工免疫原 單克隆抗體 免疫試紙檢測(cè)方法　出處：《河南科技學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：黃曲霉毒素(aflatoxin,AF)是由曲霉菌屬產(chǎn)生的具有毒性作用的次生代謝產(chǎn)物。AF對(duì)人體健康具有急性、慢性、致癌性、免疫抑制等多種毒性危害作用,自然條件下產(chǎn)生的AF主要包括B1、B2、G1、G2 4種,且這4種毒素殘留對(duì)人體健康的毒性往往具有協(xié)同和加性效應(yīng),實(shí)施黃曲霉毒素總量(total aflatoxins,TAFs)(B1+B2+G1+G2)檢測(cè)已成為當(dāng)前食品質(zhì)量安全檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢(shì)。比較各種TAFs檢測(cè)方法,GICA技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、篩檢樣品量大等優(yōu)勢(shì),是實(shí)現(xiàn)TAFs檢測(cè)的主要技術(shù)手段。本研究的目是建立TAFs免疫試紙檢測(cè)方法,為食品TAFs快速檢測(cè)提供可靠的技術(shù)支撐。本研究工作的主要內(nèi)容與結(jié)論如下:1.根據(jù)AF的分子結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn),設(shè)計(jì)出4種B族AF和3種G族AF抗原制備方法,通過UV、SDS-PAGE和動(dòng)物免疫對(duì)抗原進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,OAE法是B族AF抗原合成的最佳方法,AFB1與BSA的分子結(jié)合比為8.46∶1,動(dòng)物免疫所產(chǎn)生AFB1pAb具有高效價(jià)(免疫動(dòng)物易產(chǎn)生抗體)、敏感(IC50為17.03μg/kg)、特異(100%識(shí)別AFB1)、廣譜(同時(shí)100%識(shí)別AFB2)等特性;SA法是G族AF抗原合成的最佳方法,AFG1與BSA的分子結(jié)合比為4.32∶1,動(dòng)物免疫所產(chǎn)生AFG1 pAb同樣具有高效價(jià)(免疫動(dòng)物易產(chǎn)生抗體)、敏感(IC50為13.6μg/kg)、特異(100%識(shí)別AFG1)、廣譜(與AFG2的交叉反應(yīng)率為82.19%)等特性。3.分別用AFB1-BSA(OAE)和AFG1-BSA(SA)免疫Balb/C小鼠,細(xì)胞融合技術(shù)篩選AFB1 mAb和AFG1 mAb細(xì)胞株,體內(nèi)誘生腹水法制備AFB1 mAb和AFG1 mAb,并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明,篩選出AFB1 mAb細(xì)胞株4株,其中2A11最好,經(jīng)9次傳代分泌抗體穩(wěn)定,細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)1∶(1.28×103),腹水抗體效價(jià)為1∶(5.12×105),Ka為1.05×109 L/moL,IC50為6.22μg/kg,可100%識(shí)別AFB1,與AFB2、AFG1和AFG2交叉反應(yīng)率(cross-reactivity,CR)分別為82.31%、50.11%和12.48%,制備出了效價(jià)高、敏感性好、特異性強(qiáng)AFB1 mAb;篩選出AFG1 mAb細(xì)胞株2株,其中3F10最好,經(jīng)6次傳代分泌抗體穩(wěn)定,細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)1∶(1.28×104),腹水抗體效價(jià)為1∶(5.12×105),Ka為1.36×1010L/moL,IC50為5.04μg/kg,可100%識(shí)別AFG1,與AFG2的CR%為85.81%,與AFB1、AFB2無CR,制備出了效價(jià)高、敏感性好、特異性強(qiáng)AFG1 mAb,研究結(jié)果為AFs免疫試紙檢測(cè)方法的建立奠定了抗體基礎(chǔ)。4.根據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)原理,建立了TAFs免疫試紙(TAFs-Strip)檢測(cè)方法,TAFs-Strip具有快速(10 min)、靈敏(4μg/L)、特異(只與AF反應(yīng),與其他化合物無CR)、廣譜(可同時(shí)檢測(cè)AFB1、B2、G1、G2)、簡(jiǎn)便(不需要任何儀器與附加試劑)的優(yōu)點(diǎn),符合國(guó)內(nèi)外TAFs檢測(cè)限量標(biāo)準(zhǔn),具有廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Aflatoxin AFB is a toxic secondary metabolite produced by Aspergillus. AF has acute, chronic, carcinogenic, immunosuppressive and other toxic effects on human health. Moreover, the toxicity of these four toxins to human health often has synergistic and additive effects. The application of total aflatoxins B1B2 G2) detection has become an inevitable trend in the field of food quality and safety detection. Compared with various TAFs detection methods, gica technique is quick, simple, specific, stable and can be detected in the field. The advantages of sieving large amount of samples are the main technical means to realize the detection of TAFs. The purpose of this study is to establish the test method of TAFs immune test paper. The main contents and conclusions of this study are as follows: 1. According to the molecular structure and active sites of AF, 4 kinds of group B AF and 3 kinds of G group AF antigens were designed. The antigens were identified by SDS-PAGE and animal immunity. The results showed that the best method for the synthesis of AF antigen in group B was the molecular binding ratio of AFB1 to BSA was 8.46: 1. The AFB1pAb produced by animal immunity had high titer (immunized animals were prone to produce antibodies). The sensitive IC50 is 17.03 渭 g / kg ~ (-1), the specificity is 100%, and the wide spectrum (100%) is the best method for the synthesis of G group AF antigen. The molecular binding ratio of AFG1 to BSA is 4.32: 1. The AFG1 pAb produced by animal immunity also has high titer (immune animals). The sensitive IC50 was 13.6 渭 g 路kg ~ (-1) 路kg ~ (-1), the specificity was 100%, and the broad spectrum (the cross reaction rate with AFG2 was 82.19). 3. The Balb/C mice were immunized with AFB1-BSA-OAE and AFG1-BSA-SAA, respectively. AFB1 mAb and AFG1 mAb cell lines were screened by cell fusion technique, and AFB1 mAb and AFG1 mAbwere prepared by inducing ascites in vivo, and their immunological characteristics were analyzed. The results showed that 4 AFB1 mAb cell lines were screened, of which 2A11 was the best. After 9 passages, the antibody titer of supernatant of cell culture was 1.28 脳 10 ~ 3g ~ (-1), the titer of ascites antibody was 1.05 脳 10 ~ (5) 脳 10 ~ (5) L ~ (-1) L ~ (-1) I = 1.05 脳 10 ~ (9) L ~ (-1) L ~ (-1) I = 6.22 渭 g 路kg ~ (-1), AFB _ (1) was recognized by 100%, and the cross reaction rate with AFB _ (2) AFG1 and AFG2 was 82.31% and 12.48%, respectively. Two AFG1 mAb cell lines were screened, of which 3F10 was the best, and the antibody secreted after 6 passages was stable. The antibody titer of supernatant of cell culture was 1: 1. 28 脳 10 ~ (4g), the antibody titer of ascites was 1: 1 / 10 ~ (5) 脳 10 ~ (5) C ~ (-1) KA = 1.36 脳 10 ~ (10) L / mol / L IC50 was 5.04 渭 g / kg, the recognition rate of AFG _ (1) was 100% 渭 g / kg, the CR% with AFG2 was 85.81%, and the antibody titer was higher and the sensitivity was better than that of AFB _ (1) and AFB _ (2). According to the principle of colloidal gold immunochromatographic technique, a method for the detection of TAFs-Strip in TAFs immunized test paper was established. The Tafs-Strip has the advantages of rapid detection of 10 mins, sensitivity of 4 渭 g / L 路L ~ (-1), and specificity (only with AF). Compared with other compounds, it is not CR-free, broad-spectrum (can simultaneously detect AFB _ 1B _ 2H _ 2H _ 1G _ (1) G _ (2)), simple (without any instruments and additional reagents). It conforms to the domestic and foreign TAFs detection limit standard, and has broad market prospect and application value.
【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S859.8

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本文編號(hào)：1534276