本文關(guān)鍵詞： 車(chē)前草多糖 新城疫 雞 T淋巴細(xì)胞 提取工藝 免疫增強(qiáng)劑　出處：《西南大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來(lái)畜禽傳染病嚴(yán)重危害畜牧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,尤其是病毒性傳染病,迄今,疫苗預(yù)防是對(duì)其控制最重要的措施。許多疫苗依賴佐劑來(lái)增強(qiáng)抗原的免疫抗原性或改變宿主的保護(hù)性應(yīng)答類型。佐劑是先于抗原或與抗原同時(shí)應(yīng)用時(shí)能增強(qiáng)抗原物質(zhì)免疫原性,增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答,或改變機(jī)體免疫應(yīng)答類型的物質(zhì),單獨(dú)使用時(shí)一般無(wú)免疫原性。佐劑在免疫中的作用主要是提升機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng),包括增強(qiáng)免疫反應(yīng)強(qiáng)度和反應(yīng)的持久性。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)植物多糖具有免疫佐劑的作用,能夠增強(qiáng)疫苗的免疫效果,促進(jìn)機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫、細(xì)胞免疫與體液免疫。植物多糖類佐劑具有天然、低毒、無(wú)藥物殘留等優(yōu)點(diǎn),在使用安全性方面具有優(yōu)勢(shì)。但目前能夠應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的植物多糖類佐劑不多,尋找一種資源豐富的植物多糖類佐劑以滿足生產(chǎn)實(shí)踐需要迫在眉睫。車(chē)前草是車(chē)前草科植物,廣布全世界,有三屬約270種,在我國(guó)僅有車(chē)前屬,共18種。車(chē)前草在我國(guó)分布極廣,是一味傳統(tǒng)中藥,具有清熱、涼血、解毒、利尿等功效�，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究表明,車(chē)前草含有豐富的生物活性成分,如多糖類、黃酮類、熊果酸及苷類等。多糖是車(chē)前草發(fā)揮生物活性的主要物質(zhì)。Berit等(1995)對(duì)車(chē)前草中具有生物活性的多糖進(jìn)行分離,并探明其部分結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn),有L-阿拉伯糖(20%),D-半乳糖(28%),D-葡萄糖(6%),D-甘露糖(2%),L-鼠李糖(4%),D-葡萄糖酸(31%)及少量D-木糖和炭藻糖,主要以B-1,4連接為主鏈,2和3位含側(cè)鏈。目前關(guān)于車(chē)前草多糖作為免疫增強(qiáng)劑的研究顯有報(bào)道。本課題采用車(chē)前草多糖作為新城疫疫苗佐劑,研究車(chē)前草多糖的免疫增強(qiáng)作用。1.車(chē)前草多糖提取純化工藝及生物學(xué)活性的研究采用超聲輔助提取法提取車(chē)前草多糖,根據(jù)單因素試驗(yàn),篩選出影響多糖提取的因素及水平,通過(guò)均勻設(shè)計(jì)方法進(jìn)行因素及水平的優(yōu)化,確定最佳提取工藝為：超聲時(shí)間60min、溫度60攝氏度、料液比1：30,提取率為75.88mg/g。對(duì)提取的車(chē)前草粗制多糖進(jìn)行純化,采用三氯乙酸法脫蛋白,脫蛋白率為52.1%,采用活性炭脫色,脫色率為82.3%。對(duì)車(chē)前草理化性質(zhì)的分析：車(chē)前草多糖為黃褐色粉末狀物質(zhì)；可溶于水、稀酸、稀堿；不溶于乙醇、石油醚、丙酮、正丁醇等有機(jī)溶劑；含有還原糖：不含淀粉、單糖和二糖;車(chē)前草多糖溶液PH為7.8。車(chē)前草多糖具有體外清除自由基的作用,車(chē)前草多糖濃度70μg/ml時(shí)對(duì)·OH~的清除率為41.1%：濃度為125μg/ml時(shí)對(duì)O2~·清除率為37.2%;濃度為160μg/mll時(shí)對(duì)NO2’·清除率為72.5%。2.車(chē)前草多糖對(duì)雛雞生長(zhǎng)增重、生理生化指標(biāo)及免疫器官指數(shù)的影響用車(chē)前草多糖溶液連續(xù)6天飼喂雛雞,對(duì)照組飼喂等量生理鹽水,并于給藥后第5(D5)、10 (D10)、15 (D15)、20 (D20)、28 (D28)天,采樣進(jìn)行生長(zhǎng)增重、血常規(guī)、生理生化指標(biāo)、免疫器官臟器指數(shù)測(cè)定及免疫器官組織學(xué)觀察。結(jié)果顯示：隨著日齡增加,在D10、D15、D20、D28天,車(chē)前草多糖組雛雞體重分別為214.35g、359.71g、633.44g、826.52g極顯著的高于空白對(duì)照組；在給藥后第D 5-D15天車(chē)前草多糖組RBC(1.84～2.45×1012/L)顯著高于空白組RBC(1.40-2.14x1012/L),(P0.05)；在給藥后第D28天車(chē)前草多糖組WBC(258.8×109/L)顯著高于空白組BC (128.1×109/L), (P0.05);在給藥后第D10～D28天,車(chē)前草多糖組GOT(131.9～27.57IU/L) 和 GPT (8.53～16.99IU/L)顯著或極顯著地高于空白對(duì)照組GOT(27.2-19.67IU/L)和GPT (2.58～5.87IU/L), (P0.05, P＜0.01);在D5-D28天車(chē)前草多糖組AKP(10.47～10.15IU/L)和PCa (1.59～1.01 mmol/ml)與空白對(duì)照組AKP (7.54～3.4IU /L)和PCa(1.31～1.07 mmol/ml)差異不顯著：在D5-D28天車(chē)前草多糖組胸腺指數(shù)(2.04：-0.28-2.93-0.23)、脾臟指數(shù)(1.2±0.14～1.90±0.12)與法氏囊指數(shù)(4.11±0.46～5.98±0.25)顯著或極顯著地高于空白對(duì)照組胸腺指數(shù)(1.38±0.24-2.40±0.31)、脾臟指數(shù)(1.06+0.32～1.52±0.28)與法氏囊指數(shù)(2.54±0.77～4.47±0.29),(P0.05,P0.01)；觀察脾臟組織切片時(shí)發(fā)現(xiàn),給藥后D5-D20天,車(chē)前草多糖組的雛雞脾臟紅髓淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均較對(duì)照組多;觀察胸腺組織切片時(shí)發(fā)現(xiàn),給藥后D10～D20天,車(chē)前草多糖組的胸腺小葉面積均大于對(duì)照組；觀察法氏囊組織切片時(shí)發(fā)現(xiàn),給藥后D10-D28天時(shí)車(chē)前草多糖組的腔上囊小節(jié)顯著大于對(duì)照組。以上結(jié)果證明車(chē)前草多糖能夠促進(jìn)雛雞生長(zhǎng)增重,促進(jìn)器官發(fā)育及提高免疫水平。3.車(chē)前草多糖對(duì)新城疫疫苗免疫效果的影響將320羽1日齡雛雞隨機(jī)分為7組,即：雞新城疫(ND)疫苗免疫組、ND疫苗+車(chē)前草多糖(5Cmg/ml)組、ND疫苗+車(chē)前草多糖(25mg/ml)組、ND疫苗+車(chē)前草多糖(12.5mg/ml)組,同時(shí)設(shè)立ND疫苗+黃芪多糖(1.5g/m1)組、ND疫苗+地塞米松(2.5mg/ml)組和健康組為對(duì)照,于首次注射后第7(D7)、14 (D14)、21(D21)、35 (D35)天,每組隨機(jī)抽取雛雞采樣,測(cè)定臟器指數(shù)、血凝抑制抗體效價(jià)、外周血T淋巴細(xì)胞增殖率及外周血T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的比值。臟器指數(shù)的結(jié)果顯示：車(chē)前草多糖50m-ml劑量組胸腺指數(shù)(6.45±0.24～3.07±0.17)、脾臟指數(shù)(3.12±0.11～2.05±0.11)與法氏囊指數(shù)(7.66±0.093～3.31±0.13)及黃芪多糖組胸腺指數(shù)(6.07±0.56～3.24±0.22)、脾臟指數(shù)(3.31±0.42～2.11±0.16)與法氏囊指數(shù)(8.06±0.09～3.45±0.16)顯著或極顯著的高于ND免疫組胸腺指數(shù)(4.23±0.13～2.77±0.12)、脾臟指數(shù)(2.28±0.11～1.83±0.12)與法氏囊指數(shù)(5.86±0.45～2.97±0.12),(P0.05,P0.01)。抗體效價(jià)的結(jié)果顯示：車(chē)前草多糖50mg/ml (11.25～9.50)、25mg/ml(10.25～8.75)、12.5mg/ml(10.00～8.50)劑量組及黃芪多糖組(11.25～9.50)在D14～D28極顯著的高于ND免疫組(8.75～6.75),(P0.01)；地塞米松組(5.33～5.00)在D14～D35極顯著的低于ND免疫組(8.75～6.75),(P0.01)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的結(jié)果顯示：車(chē)前草50mg/ml劑量組(2.1733±0.042～2.0623±0.061)及黃芪多糖組(2.0678±0.059～2.0267±0.099)在D7～D28天,T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均極顯著的高于ND疫苗組(1.8967±0.031-1.7213±0.084),(P0.01)；地塞米松組(1.5633±0.045-1.5723±0.045)在D7～D21極顯著的低于ND免疫組(1.8967±0.031-1.7213±0.084),(P0.01)。CD4+/CD8+比值的結(jié)果顯示：車(chē)前草多糖50mg/ml劑量組(1.9186±0.035-1.8013±0.028)在D7-D35天CD4+/CD8+的比值極顯著或顯著的高于ND疫苗組(1.6417±0.02～1.3507±0026),(P0.01,P0.05)；車(chē)前草多糖25mg/ml(2.0347±0.035-1.7573±0.028)、12.5mg/ml劑量組(2.070±0.061～1.7487±0.02)和黃芪多糖組(2.0263±0.043-1.7620±0.03)在D14～D35天CD4+/CD8+的比值極顯著高或顯著高于ND疫苗組(1.5867±0.04-1.3507±0026),(P0.01,P0.05)；：車(chē)前草多糖50mg/n-劑量組(1.9186±0.035～2.0697±0.036)在D7～D21天CD4+/CD8+的比值顯著的高于黃芪多糖組(1.7710±0.006～1.7593±0.05),(P0.05)；地塞米松組在D7～D35天顯著的低于ND疫苗組(1.6417±0.02～1.3507±0026),(P0.01)。以上結(jié)果證明車(chē)前草多糖能夠提高ND疫苗的免疫效果。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S853.7

【參考文獻(xiàn)】

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