本文關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒 遺傳變異分析 ELISA 抗體 分離鑒定 培養(yǎng)特性 中和試驗(yàn)　出處：《河南科技大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：2010年冬季以來,由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)在全國(guó)范圍內(nèi)爆發(fā),對(duì)哺乳仔豬具有很高的致死率,造成哺乳仔豬腹瀉、嘔吐、脫水、最后衰竭而死,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究希望從PEDV分子變異情況、血清學(xué)流行情況及生長(zhǎng)特性等方面來解析河南省PEDV流行狀況和病原學(xué)特征,為PEDV的綜合防控提供依據(jù)。1.為了解河南地區(qū)PEDV M基因和ORF3基因遺傳變異情況,對(duì)2012~2015年河南省不同豬場(chǎng)的16份PEDV陽(yáng)性樣品的M基因和ORF3基因進(jìn)行克隆測(cè)序,分析其分子序列。結(jié)果如下:16個(gè)流行毒株的M基因不存在核苷酸和氨基酸的缺失和插入;16個(gè)流行毒株的M基因編碼的氨基酸同源性為96.9%~99.6%,與CV777經(jīng)典毒株、韓國(guó)毒株及2010年以后國(guó)內(nèi)流行的大多數(shù)毒株的氨基酸同源性分別為97.4%~99.1%、96.9%~99.6%和97.8%~99.6%;與CV777經(jīng)典毒株相比,除CHHe N ZZ-2012(ZZ)毒株外的15株流行毒株在第13個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變(E-Q/L)。16個(gè)流行毒株中CHHeN DF2-2012(DF2)和CHHeN DF2-2012(ZZ)毒株的ORF3基因存在49個(gè)核苷酸缺失,與CV777疫苗株核苷酸同源性為100%;與CV777經(jīng)典毒株相比,2株缺失毒株存在13個(gè)核苷酸位點(diǎn)和5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的一致突變。其余14個(gè)流行毒株相互間氨基酸同源性為98.1%~100%,與CV777經(jīng)典毒株、CV777疫苗株和韓國(guó)毒株氨基酸同源性分別為95.1%%~96.0%、90.2%%~91.1%和97.3%~99.1%,與2010年以后國(guó)內(nèi)流行的大多數(shù)毒株氨基酸同源性為97.3%~99.6%;與CV777經(jīng)典毒株相比,14個(gè)流行毒株的核苷酸和氨基酸一致突變位點(diǎn)分別為19個(gè)和8個(gè)。進(jìn)化樹分析顯示,M基因可分為4個(gè)群,河南PEDV流行毒株主要以基因3群為主,其中ZZ毒株屬于基因2群;ORF3基因分為3個(gè)群,DF2毒株和ZZ毒株分布于基因2群,其余14個(gè)毒株屬于基因3群。表明當(dāng)前河南主要流行的PEDV毒株的M基因和ORF3基因與2010年以后國(guó)內(nèi)流行的大多數(shù)毒株同源性較高,與韓國(guó)毒株親緣關(guān)系較近;與經(jīng)典毒株和疫苗株相比,其M基因和ORF3基因發(fā)生了變異。2.將原核表達(dá)純化后的PEDV N蛋白作為包被抗原,建立了PEDV間接ELSIA方法,并利用該方法對(duì)河南省200份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)組分及條件優(yōu)化,確定包被抗原濃度為0.5μg/mL,0.5%Casein 4℃封閉過夜,血清最佳稀ii釋倍數(shù)為1:100,37℃作用60min,二抗?jié)舛葹?:20000,37℃作用60min,血清臨界值s/p≥0.262,判為陽(yáng)性,s/p0.247判為陰性,介于兩者之間判為可疑。該方法對(duì)豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬及豬口蹄疫陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性。批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)在2.22%~4.21%和3.06%~10.81%。與商品化試劑盒相比,相對(duì)靈敏性和相對(duì)特異性及二者符合率分別為95.00%、97.22%和95.83%。200份臨床血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示pedv的陽(yáng)性率為66.00%,其中,發(fā)病豬場(chǎng)陽(yáng)性率為70.00%,免疫豬場(chǎng)陽(yáng)性率為85.00%,未免豬場(chǎng)陽(yáng)性率為15.00%;母豬抗體陽(yáng)性率為68.30%,仔豬和育肥豬抗體陽(yáng)性率分別為33.33%和56.7%。本研究建立的間接elisa方法具有較好的特異性、靈敏性和重復(fù)性,可用于pedv抗體檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查;對(duì)200份河南省pedv血清檢測(cè)結(jié)果顯示河南省pedv抗體陽(yáng)性率較高,但仔豬抗體陽(yáng)性率較低,需加強(qiáng)防護(hù)和綜合防控。3、為研究pedv的分離培養(yǎng)特性,本研究將鑒定為pedv陽(yáng)性的仔豬腸內(nèi)容物處理之后,接種于vero細(xì)胞上,在不含血清的病毒維持液中加入終濃度為10μg/ml的胰酶,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行rt-pcr、細(xì)胞免疫熒光(ifa)鑒定和基因序列測(cè)定;對(duì)pedv分離株的細(xì)胞培養(yǎng),增值規(guī)律及穩(wěn)定傳代等培養(yǎng)特性進(jìn)行研究;采用固定病毒-稀釋血清的方法,對(duì)不同臨床背景血清進(jìn)行抗體中和試驗(yàn)。結(jié)果顯示:將病毒接種vero細(xì)胞盲傳至第7代,出現(xiàn)cpe病變,隨著代次增加,cpe出現(xiàn)時(shí)間變短,呈現(xiàn)規(guī)律性變化,rt-pcr鑒定為陽(yáng)性,ifa檢測(cè)可見特異性熒光,s1、m、orf3基因測(cè)序結(jié)果為pedv對(duì)應(yīng)基因片段,確認(rèn)分離到一株pedv(chhen-zz)。通過fq-pcr,繪制胞內(nèi)、胞外病毒一步生長(zhǎng)曲線,胞內(nèi)病毒含量0h~12h逐步上升,12h達(dá)到峰值,之后逐漸下降,48h下降幅度突然增大;胞外病毒24h~72h出現(xiàn)快速增加,72h左右達(dá)到峰值,之后開始逐步下降。pedv從第20代到第50代,tcid50穩(wěn)定在10-5.5~10-6.2/0.1ml之間,現(xiàn)已傳至50代,tcid50值為10-6.11/0.1ml;對(duì)不同代次分離毒株的m基因和s1基因進(jìn)行序列分析,第7代與第50代之間的核苷酸同源性分別為99.6%~99.9%、99.8%~99.9%;分離毒株s1基因與cv777疫苗株同屬于基因i群,利用分離毒株進(jìn)行抗體中和試驗(yàn)顯示:臨床上未曾免疫但感染過基因iii群pedv的豬場(chǎng)血清中和抗體效價(jià)滴度幾乎為零,而疫苗免疫豬場(chǎng)血清中和抗體效價(jià)在54.1~74.9。本研究成功分離一株pedv毒株,生長(zhǎng)特性良好,能在細(xì)胞上穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。通過抗體中和試驗(yàn),證明cv777疫苗株所在基因i群毒株與基因iii群流行毒株之間的免疫交叉性差。通過分離培養(yǎng)pedvchhen-zz毒株對(duì)pedv的病原學(xué)特性進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究pedv的免疫原性及交叉保護(hù)性提供參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1525814