發(fā)布時間：2018-02-22 03:32

  本文關(guān)鍵詞： 青海血蜱 水通道蛋白(AQPs) 生物信息學分析 轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體 無細胞表達　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：蜱是專性吸血的外寄生蟲,是傳播多種人和動物疾病的第二大生物媒介,給人類健康和畜牧業(yè)帶來極大危害。蜱的防控是近年國內(nèi)外關(guān)注的焦點和研究熱點。蜱對化學藥物存在抗藥性和環(huán)境污染等缺陷,新型抗蜱制劑具有廣泛的應用前景。青海血蜱是僅在我國分布并傳播多種病原,對畜牧業(yè)造成嚴重危害的蜱種之一。蜱叮咬宿主傳播病原的過程中存在大量液體運輸活動。水通道蛋白(AQPs)是廣泛存在生物體細胞膜上一類專性介導液體跨膜轉(zhuǎn)運的重要功能蛋白,已證明在液體運輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可能作為研究蜱疫苗的關(guān)鍵蛋白之一,但蜱體內(nèi)AQPs研究甚少,生物學功能也不清楚。本研究根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的6種蜱AQPs的基因序列設(shè)計兼并引物,以青海血蜱cDNA為模板,利用RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)方法,擴增獲得青海血蜱AQPs的部分序列;在此基礎(chǔ)上設(shè)計5’和3’RACE(rapid-amplification of cDNA ends)引物,運用RT-PCR和RACE方法擴增青海血蜱AQPs全長序列,經(jīng)分析獲得青海血蜱AQPs 4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。生物信息學分析顯示,獲得的青海血蜱AQPs 4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的氨基酸順序只在3,末端存在差異,其余部分氨基酸順序一致,均有6個跨膜區(qū),無信號肽序列,疏水性較強;進化分析顯示青海血蜱AQPs 4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體與Rhipicephalus appendiculatus,Rhipicephalus sanguineus的AQPs序列同源性較高(82%),初步說明獲得的青海血蜱AQPs 4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體是正確的。根據(jù)上述獲得的青海血蜱AQPs 4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的基因序列,設(shè)計引物擴增保守區(qū)。將目的片段連接表達載體pET-28a(+),經(jīng)PCR、雙酶切及測序驗證正確后,體外無細胞進行表達并純化,SDS-PAGE及Western-blot方法驗證了蛋白的正確表達;同時將AQPs蛋白的3個外模區(qū)域合成多肽,并用多肽制備相應的多克隆抗體。以上研究結(jié)果顯示,青海血蜱AQPs基因存在轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體,對轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體相同片段進行無細胞表達并純化,并利用合成的多肽制備相應多克隆抗體,為新型抗蜱藥物或疫苗的研制提供了一定的基礎(chǔ),對揭示蜱體內(nèi)液體運輸機制和蜱防治具有重要意義。
[Abstract]:Ticks are specialized blood sucking parasites and the second largest biological vector for the spread of many human and animal diseases. In recent years, the control of ticks is the focus of attention and research focus at home and abroad. Ticks have the defects of resistance to chemical drugs and environmental pollution. The new anti-tick preparation has a wide application prospect. Haemaphysalis qinghaiensis is only distributed and spread a variety of pathogens in China. One of the ticks that cause serious harm to animal husbandry. There is a large amount of liquid transportation in the course of biting the host to spread the pathogen. Aquaporin aquaporins (AQPs) is a kind of specific liquid transmembrane transport on the cell membrane of organisms. Important functional proteins, It has been proved that it plays a key role in liquid transportation and may be one of the key proteins in the study of ticks vaccine, but there is little research on AQPs in ticks. In this study, degenerate primers were designed according to the gene sequences of six species of ticks AQPs published in NCBI database. Using RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reactionation method, partial sequences of Haemaphysalis qinghaiensis AQPs were amplified by RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reactionation method. On this basis, 5 'and 3 RACEC rapid-amplification of cDNA endings primers were designed to amplify the full-length AQPs sequence of Haemaphysalis qinghaiensis by using RT-PCR and RACE methods. Four transcriptional isomers of Haemaphysalis qinghaiensis AQPs were obtained by analysis and bioinformatics analysis. The amino acid sequence of the four transcriptional isomers of Haemaphysalis qinghaiensis was only 3, with the same amino acid sequence in the other parts, six transmembrane regions, no signal peptide sequence and strong hydrophobicity. Phylogenetic analysis showed that the four transcriptional isomers of Haemaphysalis qinghaiensis AQPs had high homology with the AQPs sequence of Rhipicephalus appendiculatusus Rhipicephalus sanguineus, which indicated that the four transcriptional isomers of Haemaphysalis qinghaiensis AQPs were correct. According to the above obtained AQPs, four AQPs species of Haemaphysalis qinghaiensis were obtained. The gene sequence of the transcriptional isomer, The primers were designed to amplify the conserved region. The target fragment was ligated into the expression vector pET-28a (pET-28a), which was confirmed by PCR-, double-enzyme digestion and sequencing, and then expressed without cells in vitro and purified by SDS-PAGE and Western-blot methods to verify the correct expression of the protein. At the same time, the polypeptides were synthesized from the three outer model regions of AQPs protein, and the corresponding polyclonal antibodies were prepared by the polypeptides. The results showed that the AQPs gene of Haemaphysalis qinghaiensis had transcriptional isomers. The same fragment of the transcriptional isomer was expressed and purified without cells, and the polyclonal antibody was prepared by using the synthesized polypeptide, which provided a basis for the development of new anti-tick drugs or vaccines. It is of great significance to reveal the mechanism of liquid transport in ticks and to control ticks.
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.746

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