本文關(guān)鍵詞： 水牛胎兒 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 低氧 轉(zhuǎn)染效率　出處：《廣西大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本研究以水牛胎兒四肢長(zhǎng)骨骨髓為分離對(duì)象,采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)水牛胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),首先比較了不同胎兒大小和不同血清濃度對(duì)水牛胎兒BMSCs增殖效果和分化情況的影響,并對(duì)所分離得到的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定；同時(shí)探討了水牛胎兒BMSCs分別培養(yǎng)在常氧條件(20%02)和低氧條件(5%02)下細(xì)胞表面抗原、間質(zhì)標(biāo)記基因、應(yīng)力纖維和核型的變化情況；另外,還比較了水牛胎兒BMSCs和水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BFFs)用不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)其轉(zhuǎn)染效果的影響,以期建立一套穩(wěn)定的水牛胎兒BMSCs分離培養(yǎng)體系和高效轉(zhuǎn)染外源基因的方法。研究結(jié)果如下：(1)隨著培養(yǎng)基中血清濃度的增加,細(xì)胞增殖速度加快；細(xì)胞周期檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)15%血清濃度中處于G0/G1期的細(xì)胞比例最小(35.8%vs52.4%,P0.01;35.8%vs51.6%,P0.01),10%血清濃度和20%血清濃度的差異不顯著(52.4%vs51.6%,P0.05)；但從細(xì)胞形態(tài)來(lái)看隨著血清濃度的增加,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)鈣沉積的細(xì)胞數(shù)量也隨之增多。分離自不同大小胎牛的水牛胎兒BMSCs培養(yǎng)在10%血清濃度的培養(yǎng)基中,細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別均與典型的MSCs細(xì)胞形態(tài)相似。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均成“S”型,增殖速率與細(xì)胞代數(shù)和胎牛大小有關(guān)：10cm以下的水牛胎兒不易分離得到其骨髓,10cm～17cm的胎牛來(lái)源的BMSCs在3代以內(nèi)隨著代數(shù)的增加增殖速度加快,傳至4代后,其增殖速度隨著代數(shù)的增加而下降；17cm以上胎牛來(lái)源的BMSCs其增殖速率,第2代高于第1代細(xì)胞,第3代開(kāi)始下降且低于第1代細(xì)胞。(2)對(duì)所分離得到的水牛胎兒BMSCs進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定發(fā)現(xiàn)：RT-PCR檢測(cè)到第3代細(xì)胞表達(dá)oct4、sox2、nanog等多能因子和CD73、CD90、CD105等細(xì)胞表面抗原。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)第3代細(xì)胞表達(dá)OCT4、Nanog和CD73。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：第3代、第5代、第10代、第15代和第20代細(xì)胞的CD29和CD44的陽(yáng)性率均大于95%,造血干細(xì)胞表面抗原CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31的陽(yáng)性率均小于2%。體外誘導(dǎo)分化試驗(yàn)表明第3代細(xì)胞可以被定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞。(3)在常氧培養(yǎng)條件下,水牛胎兒BMSCs隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加,CD29+陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸下降；細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維合成受阻,細(xì)胞形態(tài)由梭形逐漸轉(zhuǎn)變成多邊型;培養(yǎng)至10代后,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記(mesenchymal marker)基因：snail、slug、fn1、N-Cadhering mRNA的表達(dá)水平下降。然而,在低氧培養(yǎng)條件下,免疫熒光染色結(jié)果顯示：細(xì)胞內(nèi)的低氧誘導(dǎo)因子1、2(HIF-1、HIF-2)的表達(dá)被激活,其下游基因twist的表達(dá)量亦隨之升高,與此同時(shí)間質(zhì)標(biāo)記基因snail、slug、fn1、N-Cadhering、coll a的表達(dá)量亦隨之升高；細(xì)胞黏附試驗(yàn)表明,低氧條件下細(xì)胞的黏附性較于常氧條件下更小,更具有間質(zhì)細(xì)胞特性；細(xì)胞免疫熒光染色亦表明：在低氧條件下,水牛胎兒BMSCs的應(yīng)力纖維較在常氧下合成更穩(wěn)定,表達(dá)量更高。培養(yǎng)于低氧條件下的P3、P10和P20水牛胎兒BMSCs核型分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明隨著細(xì)胞代數(shù)的增加,核型正常率下降,培養(yǎng)于低氧條件下的P10、P20細(xì)胞核型正常率高于常氧條件下的(4)在轉(zhuǎn)染試劑相同的情況下,相同代數(shù)的水牛胎兒BMSCs轉(zhuǎn)染效率顯著高于BFFs(15.6%±0.1713.3%±0.13,P0.05;23.9%±0.2119.1%±0.2 2,P0.05);轉(zhuǎn)染同一種細(xì)胞的情況下,轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 3000的轉(zhuǎn)染效率顯著高于Roche(?) X-tremegene(19.1%±0.2213.3%±0.13,P0.05 ;23.9%±0.2115.6%±0.17,P0.05)。在此基礎(chǔ)上利用LipofectamineTM 3000將帶有催乳素(PRL)基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染了相同代數(shù)的水牛胎兒BMSCs和BFFs,水牛胎兒BMSCs轉(zhuǎn)染效率同樣顯著高于BFFs (18.5%±0.1916.4%士0.14,P0.05)；PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有PRL基因整合。結(jié)論：(1)從10-17cm長(zhǎng)的水牛胎兒長(zhǎng)骨分離的骨髓利用全骨髓貼壁法可以分離得到具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的BMSCs;(2)水牛胎兒BMSCs在10%的血清濃度和低氧(5%O2)條件下體外培養(yǎng),細(xì)胞中HIF-Twist軸被激活,其下游靶基因snail、slug、N-Cadherin、fn1和colla1表達(dá)量升高,從而有助于BMSCs維持其間質(zhì)干細(xì)胞的特性和更穩(wěn)定的核型；(3)在質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑相同的情況下,水牛胎兒BMSCs的轉(zhuǎn)染效率顯著高于BFFs。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823.83

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