本文關(guān)鍵詞： 豬圓環(huán)病毒2型 重組腺病毒 基因工程疫苗 免疫原性　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)是由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)引起的豬傳染性疾病。接種疫苗是防控PCVAD最有效的手段,重組腺病毒載體疫苗已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道,但是由于腺病毒自身蛋白可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),從而限制了這種疫苗在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用,如何降低自身免疫應(yīng)答反應(yīng)成為重組腺病毒載體疫苗規(guī)�；瘧�(yīng)用必須解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究構(gòu)建了4類PCV2重組腺病毒載體疫苗,一是利用人巨細(xì)胞病毒第一內(nèi)含子(human cytomegalovirus first intron,Intron A)和土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE),構(gòu)建Intron A和/或WPRE優(yōu)化的PCV2重組腺病毒載體疫苗;二是通過共表達(dá)豬腫瘤壞死因子相關(guān)激活蛋白(tumor necrosis factor related activation protein,TRAP/CD40L)和粒細(xì)胞-巨細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GMCSF),構(gòu)建CD40L和/或GMCSF優(yōu)化的PCV2重組腺病毒載體疫苗;三是分別在CD40L、Cap和GMCSF的N端添加分泌型信號肽,構(gòu)建分泌型重組腺病毒載體疫苗;四是分別在CD40L和GMCSF的N端添加分泌型信號肽,Cap N端添加跨膜型信號肽,構(gòu)建跨膜型重組腺病毒載體疫苗。4類重組腺病毒載體疫苗均進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)評價(jià)免疫效果,期望構(gòu)建的這4類PCV2重組腺病毒載體疫苗能夠提高PCV2 Cap的表達(dá)效率和表達(dá)方式,從而降低腺病毒疫苗免疫劑量,減弱腺病毒載體自身的免疫原性,增強(qiáng)疫苗免疫效果,為PCV2重組腺病毒載體疫苗的規(guī)�；瘧�(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究取得以下結(jié)果。1.將Intron A和WPRE克隆到PCV2重組腺病毒,構(gòu)建PCV2 Cap、Intron A和WPRE相關(guān)重組腺病毒疫苗,分別命名為Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W。western blotting結(jié)果表明,在Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染細(xì)胞的蛋白樣品中均可檢測到Cap表達(dá),并且Ad-A-C-W感染細(xì)胞的Cap表達(dá)量高于其他組。IFA結(jié)果表明,Ad-C、Ad-A-C、Ad-C-W和Ad-A-C-W感染的細(xì)胞均能檢測到熒光,并且Ad-A-C-W感染細(xì)胞的熒光信號強(qiáng)于其他組。使用上述構(gòu)建的重組腺病毒免疫小鼠2次,間隔14 d。結(jié)果表明,一免后14 d開始檢測到特異性抗體和中和抗體。一免后35 d至一免后56 d,Ad-A-C-W免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平顯著高于其他組(p0.05),Ad-A-C免疫組和Ad-C-W免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平差異不顯著,但均顯著高于Ad-C免疫組(p0.05)。一免后28 d至一免后56 d,Ad-A-C-W免疫組淋巴細(xì)胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平顯著高于其他組(p0.05),Ad-A-C免疫組和Ad-C-W免疫組差異不顯著,但均顯著高于Ad-C免疫組(p0.05)。2.將CD40L和GMCSF克隆到PCV2重組腺病毒,構(gòu)建PCV2 Cap、CD40L和GMCSF相關(guān)重組腺病毒疫苗,分別命名為Ad-CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF。western blotting和IFA結(jié)果顯示,重組腺病毒Ad-CD40L-Cap、Ad-Cap-GMCSF和Ad-CD40L-Cap-GMCSF均可以檢測到相應(yīng)蛋白表達(dá)。使用上述構(gòu)建的重組腺病毒免疫小鼠2次,間隔14 d。結(jié)果表明,一免后14 d開始檢測到特異性抗體和中和抗體。一免后21 d至一免后56 d,Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平顯著高于其他組(p0.05),Ad-CD40L-Cap免疫組和Ad-Cap-GMCSF免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平差異不顯著,但均顯著高于Ad-Cap免疫組(p0.05)。一免后28 d至一免后56 d,Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組淋巴細(xì)胞增殖水平、IFN-γ和IL-4分泌水平顯著高于其他組(p0.05),Ad-CD40L-Cap免疫組和Ad-Cap-GMCSF免疫組差異不顯著,但均顯著高于Ad-Cap免疫組(p0.05)。3.將重組腺病毒Ad-Cap、Ad-A-C-W和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫豬,進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn),一免后14 d加強(qiáng)免疫,一免后28 d攻毒。結(jié)果顯示,一免后21 d至一免后77 d,Ad-A-C-W免疫組和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組特異性抗體水平和中和抗體水平顯著高于Ad-Cap免疫組(p0.05)。一免后28 d,Ad-A-C-W免疫組淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平顯著高于Ad-Cap免疫組(p0.05),但是顯著低于Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組(p0.05)。一免后35 d至一免后91 d,Ad-A-C-W免疫組和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組病毒載量均顯著低于Ad-Cap免疫組(p0.05)。一免后91 d試驗(yàn)結(jié)束后對各試驗(yàn)組豬進(jìn)行了尸體剖檢和組織病理學(xué)檢查。Ad-Cap免疫組、Ad-A-C-W免疫組和Ad-CD40L-Cap-GMCSF免疫組均未見明顯的解剖病理變化,鏡檢也未見明顯的組織學(xué)病變。4.首先構(gòu)建重組腺病毒Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W,然后分別在CD40L、Cap和GMCSF N端添加分泌信號肽,構(gòu)建重組腺病毒Ad-A-sp Cap-W和Ad-A-sp CD40L-sp Cap-sp GMCSF-W,分別在CD40L和GMCSF N端添加分泌型信號肽,Cap N端添加跨膜型信號肽,構(gòu)建重組腺病毒Ad-A-sp CD40L-tp Cap-sp GMCSF-W。western blotting結(jié)果表明,Ad-A-sp Cap-W和Ad-A-sp CD40L-sp Cap-sp GMCSF-W感染細(xì)胞上清中可檢測到Cap表達(dá),Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W和Ad-A-sp CD40L-tp Cap-sp GMCSF-W感染細(xì)胞裂解蛋白中可檢測到Cap表達(dá),Ad-A-sp CD40L-sp Cap-sp GMCSF-W和Ad-A-sp CD40L-tp Cap-sp GMCSF-W感染細(xì)胞上清可檢測到CD40L和GMCSF表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W表達(dá)的Cap主要定位于PK15細(xì)胞質(zhì),Ad-A-sp CD40L-tp Cap-sp GMCSF-W表達(dá)的Cap主要定位于PK15細(xì)胞膜。5.將45頭豬隨機(jī)分為9組,每組5頭,分別接種重組腺病毒Ad-Cap(組1)、Ad-A-sp Cap-W(組2)、Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W(組3)、Ad-A-sp CD40L-sp Cap-sp GMCSF-W(組4)、Ad-A-sp CD40L-tp Cap-sp GMCSF-W(組5)、商品化疫苗(組6)和空載體腺病毒Ad-wild(組7),第8組為非免疫攻毒組(組8),第9組為空白對照組(組9),評價(jià)疫苗的保護(hù)效果。一免后14 d加強(qiáng)免疫,一免后28 d攻毒。結(jié)果顯示,一免后28 d至一免后49 d,組2特異性抗體水平顯著低于組6(p0.05),其余時(shí)間點(diǎn)與組6差異不顯著。一免后35 d至一免后63 d,組3特異性抗體水平顯著高于組6(p0.05)。一免后14 d至一免后70 d,組4和組5特異性抗體水平顯著高于組6(p0.05)。western blotting結(jié)果表明,一免后14 d,組2、組3、組4和組5豬血清就可以與Cap特異性結(jié)合。一免后14 d至一免后70 d,組2中和抗體水平與組6差異不顯著。一免后35 d至一免后63 d,組3中和抗體水平顯著高于組6(p0.05)。一免后21 d至一免后70 d,組4和組5中和抗體水平顯著高于組6(p0.05)。一免后28 d,組2和組3淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平與組6差異不顯著,組4和組5淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ和IL-13水平顯著高于組6(p0.05)。一免后35 d至一免后70 d,組2病毒載量和組6差異不顯著。一免后49 d至一免后70 d,組3病毒載量顯著低于組6(p0.05)。一免后42 d至一免后70 d,組4和組5病毒載量均顯著低于組6(p0.05)。一免后70 d,對各組豬進(jìn)行尸體剖檢和組織病理學(xué)檢查,組2、組3、組4和組5豬均未見明顯病理變化。本研究通過對腺病毒載體進(jìn)行優(yōu)化,構(gòu)建了4類PCV2重組腺病毒疫苗,第一類是Intron A和/或WPRE優(yōu)化的PCV2重組腺病毒疫苗;第二類是CD40L和/或GMCSF優(yōu)化的PCV2重組腺病毒疫苗;第三類是分別在CD40L、Cap和GMCSF N端添加分泌型信號肽的重組腺病毒疫苗;第四類是分別在CD40L和GMCSF N端添加分泌型信號肽,Cap N端添加跨膜型信號肽的重組腺病毒疫苗。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明,新構(gòu)建的4類疫苗均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中,第一類疫苗中的Ad-A-C-W和第二類疫苗中的Ad-CD40L-Cap-GMCSF動(dòng)物免疫效果優(yōu)于單一Intron A、WPRE、CD40L和GMCSF的PCV2重組腺病毒疫苗,并且前者優(yōu)于后者,但是它們的免疫效果與商品化疫苗仍有差距。第三類疫苗中Ad-A-sp CD40L-sp Cap-sp GMCSF-W和第四類疫苗中Ad-A-sp CD40L-tp Cap-sp GMCSF-W對豬的免疫保護(hù)效果最好,并且優(yōu)于商品化疫苗。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.28

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