本文關(guān)鍵詞： RNAi CDV N基因 H基因　出處：《吉林大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：犬瘟熱(canine distemper,CD),是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)感染犬科等動(dòng)物引起的一種高接觸性的烈性傳染病。該病傳染性強(qiáng),死亡率高,范圍遍布全世界,給動(dòng)物保護(hù)和經(jīng)濟(jì)養(yǎng)犬業(yè)造成了巨大的損失。目前該病以預(yù)防為主,尚無(wú)有效治療手段。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象,是古老的生物體內(nèi)的自我防御機(jī)制。RNA干擾技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒病、治療和靶點(diǎn)選擇、保護(hù)宿主免受病毒感染、病毒基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)目的蛋白、抑制抗原表達(dá),揭示病毒與宿主相互作用的影響。CDV核衣殼蛋白(nucleocapsid,N)是包裹在RNA外的一層螺旋狀蛋白,是CDV基因中最保守的區(qū)域。N蛋白基因組中存在9個(gè)堿基的T細(xì)胞表達(dá)基因。CDV血凝素蛋白(hemagglutinin,H)是存在于病毒囊膜表面的蛋白,主要功能是介導(dǎo)病毒粘附宿主細(xì)胞膜,在病毒入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)以CDV的H基因和N基因作為靶基因,進(jìn)行si RNA抑制病毒增殖的研究,為CDV的防控和治療提供新思路及方法。本實(shí)驗(yàn)研究CDV在Vero細(xì)胞中的增殖特性。采用五種檢測(cè)方法對(duì)Vero細(xì)胞接種CDV后不同時(shí)間段的增殖情況進(jìn)行了檢測(cè)。免疫熒光(IFA)結(jié)果顯示,感染CDV 12h后觀察到少量細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光,48h后大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光;細(xì)胞病變(CPE)分析發(fā)現(xiàn),感染CDV 36h后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)病變,48h后大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變;半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)結(jié)果顯示,感染CDV在36h-48h之間,病毒滴度值明顯增高,表明病毒進(jìn)入指數(shù)增殖期,48h后增殖速度減緩;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印記(western blot)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDV增殖趨勢(shì)與TCID50結(jié)果一致。綜合上述結(jié)果表明,CDV感染細(xì)胞12h后可以檢測(cè)到子代病毒;36h后進(jìn)入指數(shù)增殖期;48h后病毒增殖速度減緩;在72h病毒滴度達(dá)到峰值。針對(duì)CDV H基因和N基因設(shè)計(jì)并合成si RNA各三對(duì),轉(zhuǎn)染細(xì)胞后感染病毒。經(jīng)過(guò)如下方法檢測(cè):IFA結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染細(xì)胞感染CDV 48h后,6個(gè)干擾組細(xì)胞出現(xiàn)的綠色熒光明顯少于對(duì)照組;CPE結(jié)果表明,6個(gè)干擾組細(xì)胞病變比正常對(duì)照組少;TCID50結(jié)果表明:6個(gè)干擾組病毒感染滴度分別是對(duì)照組的1/293、1/11、1/29、1/83、1/302、1/90;Real-time PCR結(jié)果顯示,6個(gè)干擾組的CDV基因拷貝數(shù)分別是對(duì)照組的12.96%、57.75%、23.47%、31.82%、12.82%、15.58%。western blot結(jié)果顯示,干擾組病毒蛋白表達(dá)量少于對(duì)照組。以上結(jié)果表明,6對(duì)si RNAs均對(duì)CDV在vero細(xì)胞中的復(fù)制具有不同程度的抑制作用。其中H基因中以si H2效果最好,N基因中以si N1效果最好。針對(duì)RNAi技術(shù)中si RNA轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)進(jìn)行研究。分別設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)組:A感染病毒前進(jìn)行轉(zhuǎn)染;B感染病毒后0-12h進(jìn)行轉(zhuǎn)染;C感染病毒12h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)五種檢測(cè)方法檢測(cè)CDV增殖情況。IFA結(jié)果表明,在接種病毒前進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組幾乎沒(méi)有綠色熒光,而其他實(shí)驗(yàn)組大多數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生熒光效果;CPE結(jié)果表明,在接種病毒前進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞病變比其他實(shí)驗(yàn)組少;TCID50結(jié)果表明,在接種病毒前進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)病毒滴度明顯低于其他實(shí)驗(yàn)組;Real-time PCR結(jié)果與TCID50結(jié)果一致。western blot檢測(cè)結(jié)果同樣表明接種病毒前進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組病毒蛋白表達(dá)量減少。以上結(jié)果表明,感染CDV前轉(zhuǎn)染si RNA對(duì)病毒抑制效果最好,有效抑制時(shí)間為72-84h。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果能為抗CDV感染提供參考依據(jù);同時(shí),也為CDV感染過(guò)程中病毒的基因功能分析提供新思路。
[Abstract]:CDV nuclear capsid protein ( CDV ) is one of the most conserved regions in Vero cells . The results showed that the expression of CDV in 6 interfering groups was significantly lower than that in the control group . The results showed that the expression of CDV gene was lower than that in the control group . The effective inhibition time is 72 - 84h . The experimental results can provide a reference for anti - CDV infection , meanwhile , it provides a new idea for gene function analysis of virus in the process of CDV infection .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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