本文關(guān)鍵詞： 新城疫病毒 磷蛋白 單鏈抗體 胞內(nèi)抗體 穿膜抗體 生物活性　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：新城疫目前仍是大多數(shù)養(yǎng)禽國(guó)危害最嚴(yán)重的禽病之一,不僅對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成危害,還對(duì)哺乳動(dòng)物和人類健康具有潛在的威脅。新城疫由于傳染性強(qiáng),傳播速度快,給國(guó)家和地區(qū)的貿(mào)易限制和封鎖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疾病。病毒性傳染病目前尚沒有特異性藥物治療,只能依靠疫苗免疫等進(jìn)行預(yù)防。因此,研究特異高效的抗病毒藥物是防治病毒性疫病所面臨的一項(xiàng)緊迫課題。近年來出現(xiàn)的反義RNA、RNAi等基因治療技術(shù),都試圖在細(xì)胞內(nèi)對(duì)感染的病毒在核酸水平上進(jìn)行干預(yù),從而達(dá)到抑制病毒合成的治療目的。隨著細(xì)胞生物學(xué)和抗體工程技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了一種新興細(xì)胞內(nèi)免疫及治療技術(shù)——胞內(nèi)抗體技術(shù)。胞內(nèi)抗體技術(shù)是將小分子抗體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞的一系列生物過程發(fā)生改變的技術(shù),該技術(shù)通過特異性干擾或阻斷細(xì)胞內(nèi)特定生物大分子合成、加工和分泌過程而發(fā)揮作用。鑒于新城疫病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合體蛋白在病毒復(fù)制增殖過程中所處的關(guān)鍵環(huán)節(jié),本研究擬研制能夠與新城疫病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合體蛋白之一的磷蛋白結(jié)合的胞內(nèi)抗體。通過胞內(nèi)抗體與P蛋白在NDV感染的細(xì)胞內(nèi)特異性結(jié)合,從而對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成進(jìn)行干擾及對(duì)病毒增殖進(jìn)行抑制,為新城疫病毒特效藥物的研發(fā)以及病毒復(fù)制機(jī)制的研究提供一種新的思路。為此,本論文從以下幾個(gè)方面開展研究。1、雞源性抗新城疫病毒磷蛋白的單鏈抗體(sc Fv)的篩選及鑒定(1)雞源性單鏈抗體基因表達(dá)文庫的建立單鏈抗體是將抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)通過一段柔性的連接肽(linker)連接所形成的兩個(gè)可變區(qū)首尾相連的單一肽鏈。通過用NDV VG/GA型疫苗免疫雞,提取其脾臟總m RNA。設(shè)計(jì)雞抗體編碼基因特異性引物,采用RT-PCR和PCR技術(shù)擴(kuò)增出抗NDV單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因,利用重疊延伸PCR將VH和VL通過一條linker連接起來(VH-linker-VL)構(gòu)建sc Fv。將sc Fv基因克隆于原核表達(dá)載體p OPE101-XP,該載體主要用于單鏈抗體的表達(dá)和篩選。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒p OPE101-XP-sc Fv轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109,PCR鑒定為陽性的克隆送檢測(cè)序。挑選測(cè)序正確的陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),提取周質(zhì)腔可溶性sc Fv,SDS-PAGE檢驗(yàn)表達(dá)結(jié)果證明成功構(gòu)建了雞源性單鏈抗體表達(dá)文庫。經(jīng)計(jì)算單鏈抗體庫庫容量為3.8×106,可用于下一步單鏈抗體的篩選。(2)抗新城疫病毒磷蛋白(P)單鏈抗體的篩選及鑒定根據(jù)Genbank中已經(jīng)發(fā)表的禽源性新城疫病毒F48E9磷蛋白的基因序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,運(yùn)用RT-PCR方法從基因組中擴(kuò)增出P蛋白編碼基因的c DNA。P蛋白編碼基因全長(zhǎng)1287 bp,編碼429個(gè)氨基酸。同時(shí)將測(cè)序正確的P蛋白基因序列連接原核表達(dá)載體構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a-P,進(jìn)而表達(dá)出P蛋白,為篩選針對(duì)磷蛋白的單鏈抗體提供抗原。以純化后的新城疫病毒磷蛋白為抗原,建立并優(yōu)化可用于篩選抗NDV磷蛋白sc Fv的間接ELISA方法。從上述構(gòu)建的單鏈抗體庫中進(jìn)行篩選,獲得兩株親和力較高的陽性克隆sc Fv ZL.17和sc Fv ZL.103。對(duì)雞源性抗新城疫病毒磷蛋白單鏈抗體的基因序列分析,結(jié)果表明高變區(qū)主要集中于CDR區(qū),堿基變化很大。Western blot分析表明兩株單鏈抗體都能夠與病毒的磷蛋白特異性結(jié)合。2、抗新城疫病毒磷蛋白胞內(nèi)抗體在細(xì)胞中的表達(dá)及生物活性分析為獲得針對(duì)NDV磷蛋白的細(xì)胞內(nèi)抗體,本研究將上述兩個(gè)單鏈抗體編碼基因克隆到真核表達(dá)載體pc DNA3.1(+),成功構(gòu)建了針對(duì)磷蛋白的胞漿型胞內(nèi)抗體表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17。采用脂質(zhì)體分別將pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),通過RT-PCR和Western blot分析證明,在細(xì)胞內(nèi),其編碼胞內(nèi)抗體的m RNA獲得轉(zhuǎn)錄,胞內(nèi)抗體成功表達(dá),間接免疫熒光技術(shù)也進(jìn)一步證實(shí)胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。流式細(xì)胞證明重組胞內(nèi)抗體對(duì)宿主細(xì)胞活性無顯著影響;并且通過Western blot和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)評(píng)估了表達(dá)的胞內(nèi)抗體在細(xì)胞內(nèi)與新城疫病毒磷蛋白的結(jié)合能力,證明胞內(nèi)抗體能夠在細(xì)胞內(nèi)與磷蛋白能夠特異性結(jié)合。通過亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)抗體主要分布于細(xì)胞質(zhì),與磷蛋白的分布區(qū)域正好重疊�？沽椎鞍装麅�(nèi)抗體與新城疫病毒相互作用后,血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)抗體pc DNA3.1-sc Fv ZL103和pc DNA3.1-sc Fv ZL17能夠阻斷病毒對(duì)細(xì)胞的侵染,因而對(duì)NDV感染的細(xì)胞具有保護(hù)效果,依次是p CDNA3.1-sc Fv ZL103p CDNA3.1-sc Fv ZL17BHK21。通過熒光定量PCR證明,胞內(nèi)抗體具有干擾c RNA、v RNA和m RNA合成的效果,具有抑制病毒產(chǎn)生的功能。3、可穿膜的重組胞內(nèi)抗體融合蛋白的表達(dá)及生物活性研究上述抗體需要通過脂質(zhì)體才能導(dǎo)入細(xì)胞,既繁瑣,效率也不高。為了探索能順利將抗體導(dǎo)入細(xì)胞的方法及構(gòu)建穿膜型胞內(nèi)抗體,本研究選擇報(bào)道的融合穿膜肽HIV-TAT衍生片段CTP512,將其分別和上述篩選的兩個(gè)單鏈抗體表達(dá)基因融合,導(dǎo)入原核表達(dá)載體p ET28a(+),構(gòu)建穿膜型胞內(nèi)抗體表達(dá)質(zhì)粒p ET28a-sc Fv ZL-CTP。進(jìn)行了穿膜抗體生物學(xué)特性研究,設(shè)計(jì)不同穿膜抗體濃度進(jìn)行穿膜實(shí)驗(yàn),篩選出最佳的穿膜濃度為3μM;MTT法檢測(cè)CTP融合穿膜抗體對(duì)細(xì)胞活性的影響,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,穿膜抗體蛋白對(duì)細(xì)胞的增殖和活力無明顯影響;間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析顯示,穿膜抗體定位于細(xì)胞漿,能與磷蛋白分布區(qū)域重疊;TCID50檢測(cè)穿膜抗體對(duì)DNV感染細(xì)胞的保護(hù)效果,結(jié)果顯示,穿膜抗體對(duì)細(xì)胞有明顯保護(hù)效果,依次是p ET28a-sc Fv ZL103-CTPp ET28a-sc Fv ZL17-CTPControl,與空白對(duì)照相比差異顯著(P≤0.05);熒光定量PCR檢測(cè)穿膜抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)NDV復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的影響,結(jié)果顯示,穿膜抗體顯著降低了NDV的c RNA、v RNA和m RNA的含量,表明其具有抑制NDV復(fù)制的功能。本研究結(jié)果不僅為跨膜型胞內(nèi)抗體研究提供了一種新思路,也為研究外源蛋白導(dǎo)入細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)膜技術(shù)提供了有益借鑒。本研究利用基因重組技術(shù),首先成功構(gòu)建了庫容量為3.8×106雞源性單鏈抗體庫,并從庫中篩選到針對(duì)磷蛋白的兩株單鏈抗體;根據(jù)胞內(nèi)抗體構(gòu)建策略,研制了針對(duì)新城疫病毒磷蛋白的胞內(nèi)抗體,實(shí)驗(yàn)證實(shí)胞內(nèi)抗體對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)效果及干擾新城疫病毒基因在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄;成功構(gòu)建跨膜型胞內(nèi)抗體導(dǎo)入質(zhì)粒,使胞內(nèi)抗體與蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域融合表達(dá),實(shí)驗(yàn)證實(shí)穿膜抗體定位于細(xì)胞漿,且對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)效果;熒光定量PCR鑒定穿膜抗體能夠干擾新城疫病毒感染細(xì)胞后的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。本研究為研究NDV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖機(jī)制,篩選細(xì)胞內(nèi)有效抗NDV抗體,進(jìn)而探索細(xì)胞內(nèi)治療NDV等病毒感染新途徑進(jìn)行了有益探索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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