本文關(guān)鍵詞： 豬圓環(huán)病毒2型 畢赤酵母 表達(dá)系統(tǒng) 亞單位疫苗 病毒樣顆粒　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)主要是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)引起的以生長(zhǎng)緩慢、高度呼吸困難、嚴(yán)重腹瀉、黃疸、淋巴結(jié)極度腫大等為典型特征的疾病,多發(fā)豬群是6~16周齡的仔豬。我國(guó)自從2000年首次發(fā)現(xiàn)該病以來(lái),現(xiàn)在已經(jīng)有20多個(gè)省、自治區(qū)、直轄市發(fā)現(xiàn)豬群中有PCV2的感染,陽(yáng)性率為21%~96%。同時(shí),PCV2進(jìn)入機(jī)體后,能夠破壞機(jī)體免疫系統(tǒng),導(dǎo)致免疫力降低,造成與其他疾病的混合感染。因此,每年由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失非常巨大。目前該病沒(méi)有有效的治療方法,疫苗免疫已經(jīng)被證明是最有效的防控途徑。傳統(tǒng)的滅活疫苗存在著病毒增殖滴度低、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題,同時(shí)該類疫苗也有滅活不徹底的風(fēng)險(xiǎn),目前已經(jīng)逐漸被亞單位疫苗取代,尤其是圓環(huán)病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗。Cap蛋白由于是圓環(huán)病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白,自身能夠組裝成VLPs,并且免疫后可誘導(dǎo)針對(duì)PCV2的完全保護(hù)性免疫,因此成為圓環(huán)亞單位疫苗研究的首選抗原。本論文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的PCV Cap基因序列,按照酵母密碼子偏好性,進(jìn)行密碼子優(yōu)化,構(gòu)建了Cap蛋白的酵母表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)其分泌表達(dá)及VLPs組裝,并用小鼠模型進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)免疫效果,結(jié)果如下:1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZα-A-AHCap、pPICZα-A-AHCap-Fla、pPICZα-A-SUMO-AHCap和酵母表達(dá)菌株GS115-pPICZα-A-AHCap、GS115-pPICZα-A-AHCap-Fla、GS115-pPICZα-A-SUMO-AHCap。2.利用以上構(gòu)建的酵母表達(dá)菌株,成功獲得了重組蛋白AHCap、AHCap-Fla、SUMO-AHCap。3.透射電鏡觀察純化后的重組蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn):融合了SUMO標(biāo)簽的Cap蛋白(SUMO-AHCap)沒(méi)有VLPs的形成,N端缺失32個(gè)氨基酸的AHCap以及在C端融合flagellin佐劑的AHCap(AHCap-Fla)明顯可以看到直徑在20 nm左右的VLPs,并且重組蛋白AHCap形成的VLPs比AHCap-Fla多。4.將純化的重組蛋白AHCap、AHCap-Fla定量后制備亞單位疫苗,免疫小鼠檢測(cè)其免疫原性。間接ELISA結(jié)果顯示試驗(yàn)組小鼠血液中均含有PCV2的特異性抗體和中和抗體,IFN-γ和IL-2表達(dá)量均升高,并且在攻毒后的小鼠血清中未檢測(cè)到病毒,而免疫重組蛋白AHCap-Fla的抗體滴度和細(xì)胞因子(IFN-?、IL-2)分泌高于IFN-?、IL-2組,說(shuō)明重組蛋白AHCap-Fla和AHCap具有較好的免疫原性,但是重組蛋白AHCap-Fla的免疫效果更好。綜上,本文利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白AHCap、AHCap-Fla都可自組裝成VLPs,并都具有較好的免疫原性,以上結(jié)果為PCV亞單位疫苗的研發(fā)提供了新思路。
[Abstract]:Postweaning Multisystemic Wasting Syndrometic syndrome (PMWS) is mainly caused by porcine circovirus type 2 PCV2), which is characterized by slow growth, severe dyspnea, severe diarrhea, jaundice and extremely large lymph nodes. Since 2000, when the disease was first discovered in China, more than 20 provinces, autonomous regions and municipalities have found PCV2 infection in pigs, and the positive rate is 21%. At the same time, when PCV2 entered the body, It can destroy the body's immune system, reduce immunity, and cause mixed infections with other diseases. So the annual economic losses caused by the disease are enormous. There are no effective treatments for the disease. Vaccine immunization has been proved to be the most effective way of prevention and control. Traditional inactivated vaccines have problems such as low virus proliferation titer, high production cost and so on. At the same time, this kind of vaccine also has the risk of inactivation. Recently, it has been gradually replaced by subunit vaccine, especially the Virus-like particleso VLPs.Cap protein, which is the only structural protein of circovirus, can be assembled into VLPs by itself, and can induce complete protective immunity against PCV2 after immunization. In this paper, according to the sequence of PCV Cap gene isolated and identified in laboratory, according to the preference of yeast codon, we constructed the yeast expression vector of Cap protein. The recombinant plasmid pPICZ 偽 -A-AHCap-AHCap-pPICZ 偽 -A-AHCap-Fla-A-SUMO-AHCZ 偽 -A-SUMO-AHCap and the yeast expression strain GS115-pPICZ 偽 -A-AHCapGS115-pPICZ 偽 -A-APICZ 偽 -A-SUMO-AHCap.2were successfully constructed. The recombinant protein AHCapA AHCap-Flaa SUMO-AHCap.3.The purified recombinant protein was observed by transmission electron microscope. The results showed that the Cap protein (SUMO-AHCapp) with SUMO tag had no AHCap with 32 amino acids missing from the N-terminal of VLPs and the AHCap with flagellin adjuvant on the C-terminal. The AHCap with diameter of about 20 nm could be seen, and the recombinant protein AHCap could be formed. VLPs was more than AHCap-Fla. The purified recombinant protein AHCap-Fla was quantified and subunit vaccine was prepared. The immunogenicity of the immunized mice was detected by indirect ELISA. The results of indirect ELISA showed that the expression of PCV2 specific antibody and neutralizing antibody, IFN- 緯 and IL-2, were increased in the blood of the test group, and no virus was detected in the serum of the mice after the attack. The antibody titers and cytokines of the recombinant protein AHCap-Fla were determined. The secretion of IL 2 is higher than that of IFN? IL-2 group showed that the recombinant protein AHCap-Fla and AHCap had better immunogenicity, but the recombinant protein AHCap-Fla had better immunogenicity. In this paper, the recombinant protein AHCap-Fla expressed by Pichia pastoris can be self-assembled into VLPsand have good immunogenicity. These results provide a new idea for the development of PCV subunit vaccine.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1504360