本文關鍵詞： 雞傳染性支氣管炎病毒 氨基肽酶N 穩(wěn)定表達細胞系 感染　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)是冠狀病毒科(Coronaviridae)的單股正鏈RNA病毒。臨床上傳染性支氣管炎(IB)可以導致患病雞產(chǎn)蛋量下降,肉雞的生長速度減慢,給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。IBV不同血清型的毒株眾多,在同一地區(qū)可能同時出現(xiàn)多個血清型的毒株,且他們之間交叉保護效果較低,給IB的綜合防治帶來巨大的困難。IB致病機制的闡明,尤其是對IBV感染宿主細胞過程的研究是該病防治的基礎,有研究表明雞氨肽酶N(c APN)在IBV感染宿主細胞的過程中發(fā)揮重要作用。為了進一步研究c APN的生物學功能及其對IBV感染宿主細胞的影響,我們開展了穩(wěn)定表達c APN的MDCK細胞系建立及其初步特性的研究。本文構建了p ET30a-c APN原核重組質粒,鑒定正確的質粒轉化Rosetta宿主菌中進行誘導表達,SDS-PAGE表明重組表達蛋白分子量為113Ku,且以包涵體的形式表達。重組蛋白純化和復性后作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備其多克隆抗體。為了進行c APN穩(wěn)定表達細胞系的篩選,將pc DNA3.1-c APN轉染MDCK細胞,通過G418篩選和多次克隆篩選出穩(wěn)定表達cAPN基因的細胞株,RT-PCR和間接免疫熒光檢測表明c APN在獲得的MDCK細胞中可以穩(wěn)定表達,并命名為MDCK-c APN。病毒感染實驗表明IBV可以感染MDCK-c APN細胞,并且在接種后24 h后出現(xiàn)了典型的細胞病變,而對照MDCK細胞不能感染IBV,說明cAPN在IBV感染細胞的過程中可能作為細胞受體發(fā)揮著重要的生物學功能�？傊�,本實驗篩選成功穩(wěn)定表達cAPN的MDCK-c APN細胞系,為進一步研究IB致病機理及在IBV毒株的分離和生物學特性鑒定方面奠定了基礎。
[Abstract]:Infectious bronchitis virus (IBV) is a coronavirus (Coronaviridae) positive strand RNA virus. The clinical infectious bronchitis (IB) can cause the ill chicken egg production decreased, broiler growth slowed, resulting in significant economic losses to the aquaculture industry.IBV different serotype strains are numerous, and there were several serum the strain could be in the same area, and their cross protection is low, to clarify prevention and cure of IB difficult.IB pathogenic mechanism of huge, especially on IBV infection of host cells is the basis for the disease prevention and treatment, research has shown that chicken aminopeptidase N (C APN) play an important in the process of IBV infection of host cells. In order to further study the biological function of C APN and IBV infection of the host cells, and the characteristics of the MDCK cell line was established we carried out the stable expression of C APN The study of P ET30a-c APN. We construct the Prokaryotic Recombinant Plasmid, the plasmid and transformed into E.coli Rosetta for expression, SDS-PAGE showed that the recombinant protein molecular weight is 113Ku, and the expression in the form of inclusion bodies. After purification and renaturation of recombinant proteins as by immunization of New Zealand white rabbits to prepare polyclonal in order to carry out the screening of antibody. Cells stably expressing C APN, PC DNA3.1-c APN was transfected into MDCK cells by G418 screening and repeatedly screened clones with stable expression of cAPN gene in cell lines, RT-PCR and indirect immunofluorescence assay showed that C APN can be stably expressed in the MDCK cells, and named IBV that can be infected with MDCK-c APN cells MDCK-c APN. virus infection, and at 24 h after inoculation appeared typical cytopathic effect, while the control MDCK cells can not be infected with IBV, cAPN in IBV infected cells. In the process, it may play an important biological function as a cell receptor. In short, we successfully screened MDCK-c APN cell lines stably expressing cAPN, which laid the foundation for further study of IB pathogenesis and isolation and biological characteristics identification of IBV strains.

【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【共引文獻】

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本文編號：1502432