本文關(guān)鍵詞： 雞傳染性支氣管炎病毒 氨基肽酶N 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 感染　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)是冠狀病毒科(Coronaviridae)的單股正鏈RNA病毒。臨床上傳染性支氣管炎(IB)可以導(dǎo)致患病雞產(chǎn)蛋量下降,肉雞的生長(zhǎng)速度減慢,給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。IBV不同血清型的毒株眾多,在同一地區(qū)可能同時(shí)出現(xiàn)多個(gè)血清型的毒株,且他們之間交叉保護(hù)效果較低,給IB的綜合防治帶來(lái)巨大的困難。IB致病機(jī)制的闡明,尤其是對(duì)IBV感染宿主細(xì)胞過(guò)程的研究是該病防治的基礎(chǔ),有研究表明雞氨肽酶N(c APN)在IBV感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步研究c APN的生物學(xué)功能及其對(duì)IBV感染宿主細(xì)胞的影響,我們開(kāi)展了穩(wěn)定表達(dá)c APN的MDCK細(xì)胞系建立及其初步特性的研究。本文構(gòu)建了p ET30a-c APN原核重組質(zhì)粒,鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE表明重組表達(dá)蛋白分子量為113Ku,且以包涵體的形式表達(dá)。重組蛋白純化和復(fù)性后作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備其多克隆抗體。為了進(jìn)行c APN穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選,將pc DNA3.1-c APN轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,通過(guò)G418篩選和多次克隆篩選出穩(wěn)定表達(dá)cAPN基因的細(xì)胞株,RT-PCR和間接免疫熒光檢測(cè)表明c APN在獲得的MDCK細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá),并命名為MDCK-c APN。病毒感染實(shí)驗(yàn)表明IBV可以感染MDCK-c APN細(xì)胞,并且在接種后24 h后出現(xiàn)了典型的細(xì)胞病變,而對(duì)照MDCK細(xì)胞不能感染IBV,說(shuō)明cAPN在IBV感染細(xì)胞的過(guò)程中可能作為細(xì)胞受體發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能�？傊�,本實(shí)驗(yàn)篩選成功穩(wěn)定表達(dá)cAPN的MDCK-c APN細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究IB致病機(jī)理及在IBV毒株的分離和生物學(xué)特性鑒定方面奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Infectious bronchitis virus (IBV) is a coronavirus (Coronaviridae) positive strand RNA virus. The clinical infectious bronchitis (IB) can cause the ill chicken egg production decreased, broiler growth slowed, resulting in significant economic losses to the aquaculture industry.IBV different serotype strains are numerous, and there were several serum the strain could be in the same area, and their cross protection is low, to clarify prevention and cure of IB difficult.IB pathogenic mechanism of huge, especially on IBV infection of host cells is the basis for the disease prevention and treatment, research has shown that chicken aminopeptidase N (C APN) play an important in the process of IBV infection of host cells. In order to further study the biological function of C APN and IBV infection of the host cells, and the characteristics of the MDCK cell line was established we carried out the stable expression of C APN The study of P ET30a-c APN. We construct the Prokaryotic Recombinant Plasmid, the plasmid and transformed into E.coli Rosetta for expression, SDS-PAGE showed that the recombinant protein molecular weight is 113Ku, and the expression in the form of inclusion bodies. After purification and renaturation of recombinant proteins as by immunization of New Zealand white rabbits to prepare polyclonal in order to carry out the screening of antibody. Cells stably expressing C APN, PC DNA3.1-c APN was transfected into MDCK cells by G418 screening and repeatedly screened clones with stable expression of cAPN gene in cell lines, RT-PCR and indirect immunofluorescence assay showed that C APN can be stably expressed in the MDCK cells, and named IBV that can be infected with MDCK-c APN cells MDCK-c APN. virus infection, and at 24 h after inoculation appeared typical cytopathic effect, while the control MDCK cells can not be infected with IBV, cAPN in IBV infected cells. In the process, it may play an important biological function as a cell receptor. In short, we successfully screened MDCK-c APN cell lines stably expressing cAPN, which laid the foundation for further study of IB pathogenesis and isolation and biological characteristics identification of IBV strains.

【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1502432