發(fā)布時(shí)間：2018-02-10 16:35

  本文關(guān)鍵詞： 山羊副流感病毒3型 分離鑒定 原核表達(dá) 豚鼠 致病性　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：副流感病毒3型(Parainfluenza virus type 3,PIV3)是引起人和動(dòng)物呼吸道疾病的重要病原。主要有牛PIV3(BPIV3)和人PIV3(HPIV3),BPIV3可引起牛嚴(yán)重的呼吸道疾病,并有較高的發(fā)病率和致死率,對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的損失。但PIV3在羊群中的感染情況在國(guó)內(nèi)外都鮮有研究和報(bào)道。2013年下半年起江蘇、安徽多地山羊養(yǎng)殖場(chǎng)育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病,臨床表現(xiàn)較以往嚴(yán)重,傳統(tǒng)藥物治療的治愈率低,向我們提示了病原的特殊性。本研究將采集自表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸道癥狀的山羊臨床病料處理后接種MDBK細(xì)胞,連續(xù)傳代分離到病毒,進(jìn)一步通過(guò)病毒蝕斑純化實(shí)驗(yàn)純化病毒,經(jīng)RT-PCR和血凝性鑒定證明病毒分離成功。通過(guò)對(duì)其基因測(cè)序及病原學(xué)特性研究證實(shí)其不同于其他PIV3,是PIV3新成員,將該毒株命名為山羊副流感病毒 3 型(Caprine parainfluenza virus 3,CPIV3)JS2013 株。為了進(jìn)一步探究新分離得到的CPIV3JS2013株的致病性,本試驗(yàn)采用PIV3易感動(dòng)物豚鼠研究此病毒在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制及機(jī)體組織病理?yè)p傷等情況。攻毒后2天攻毒組的豚鼠開始出現(xiàn)打噴嚏、流鼻涕、眼分泌物增多及腹式呼吸的臨床癥狀,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)較高的致死率。攻毒后3天可以檢出病毒血癥,持續(xù)到攻毒后第7天,攻毒后第3天開始直到第14天均可以從肺組織中檢測(cè)到病毒。剖檢觀察攻毒組豚鼠,豚鼠肺出現(xiàn)實(shí)變、淤血、腫大,病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攻毒組豚鼠肺組織出現(xiàn)肺泡間隔增寬、肺泡融合、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等變化。HI試驗(yàn)表明豚鼠感染后第5天開始出現(xiàn)血凝抑制抗體,之后持續(xù)升高至21天仍保持較高的水平。以上結(jié)果表明CPIV3JS2013株對(duì)豚鼠具有較強(qiáng)的致病性,且豚鼠是一種研究CPIV3較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。以本試驗(yàn)分離的CPIV3 JS2013株純化的第4代病毒液為樣本,提取總RNA,根據(jù)GenBank上已發(fā)表的各PIV3成員的全基因組序列,設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物擴(kuò)增CPIV3 JS2013株N基因的部分片段。將其克隆到pMD18-T載體上,篩選并鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒PMD18-T-N,再將其克隆到原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a(+)上,經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32a-N,將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),表明CPIV3 JS2013株N基因獲得高效表達(dá)。Western-blot檢測(cè)表明本試驗(yàn)表達(dá)的重組N蛋白具有良好的反應(yīng)原性。將該蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體,IFA檢測(cè)顯示良好的效果。以上結(jié)果為今后建立CPIV3的診斷方法和疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Parainfluenza virus type 3 (Parainfluenza virus 3 type, PIV3) is an important pathogen of human and animal respiratory diseases. There are cattle PIV3 (BPIV3) and PIV3 (HPIV3), BPIV3 can cause serious respiratory disease of cattle, and have high morbidity and mortality, causing huge losses to the cattle industry but PIV3 infection in sheep at home and abroad are few reports on.2013 in the second half of Jiangsu, Anhui and more goat farm fattening goat appeared in respiratory tract disease, the clinical manifestations of severe than in the past, the traditional drug treatment the cure rate is low, suggesting that the particularity of the pathogen to us. This study showed severe respiratory symptoms collected from goat clinical samples after treatment were inoculated with MDBK cells, continuous passage of virus, virus plaque purification by further purification of the virus by RT-PCR and hemagglutination test, identification card The virus isolation success. By studying the characteristics of gene sequencing and confirmed that the pathogen is different from other PIV3, is a new member of PIV3, the virus named goat parainfluenza virus type 3 (Caprine parainfluenza 3 virus, CPIV3) JS2013 strains of pathogenic CPIV3JS2013 strains. In order to further explore the new isolated, this test the PIV3 susceptible animal study of this virus in guinea pig pathological injury situation and animal tissues in vivo replication. The toxic group attack 2 days after infection of guinea pigs began sneezing, runny nose, eye secretions and clinical symptoms of abdominal breathing have higher mortality during the experiment. After challenge 3 days can be detected in viremia, until seventh days after virus challenge, challenge third days after fourteenth days until we can detected the virus from lung tissue. Necropsy observation group of guinea pigs challenged guinea pig lung, real change, congestion, swelling, Histopathological detection of toxic groups of guinea pig lung tissue showed widened alveolar septum, alveolar fusion, inflammatory cell infiltration and other changes of.HI test showed that guinea pigs appeared fifth days after hemagglutination inhibition antibody continued to increase after 21 days still maintain higher level. These results showed that CPIV3JS2013 strains of guinea pigs with strong pathogenicity. The guinea pig is an experimental animal study of CPIV3 ideal. In this experiment. CPIV3 JS2013 strain of the fourth generation of purified virus liquid samples, extracted the total RNA, according to the whole genome sequence published in GenBank by PIV3 members, designed to amplify a fragment of the N gene of CPIV3 JS2013 strain 1 pairs of specific primers. It was cloned into the pMD18-T vector, screening and identification of positive recombinant plasmid PMD18-T-N, then cloned into prokaryotic expression vector pET-32a (+), the bacterium PCR, double enzyme digestion, sequencing Yang The recombinant plasmid pET-32a-N and transformed into Escherichia coli BL21 competent cells after induced by IPTG, the expression products were analyzed by SDS-PAGE showed that CPIV3 JS2013 strain N gene was expressed in.Western-blot test showed that the test expression of recombinant N protein has good immunogenicity. The response of mice immunized with polyclonal IFA antibody detection showed good results. These results laid the foundation for the development of diagnostic methods and the establishment of the CPIV3 vaccine.

【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1500957