本文關(guān)鍵詞： 鴨坦布蘇病毒 分離鑒定 單克隆抗體 抗原表位　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鴨坦布蘇病毒病(duck Tembusu virus disease)是于2010年在我國新出現(xiàn)的一種以采食、產(chǎn)蛋下降和癱瘓為特征的禽類傳染病,其病原為鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu vius,DTMUV)。DTMUV主要危害鴨和鵝,也有雞群感染發(fā)病的報道,不同來源的DTMUV分離病毒株的基因同源性均高于98%。該病在蚊蟲活躍季節(jié)發(fā)病率高,但冬季也有發(fā)病,因此傳播途徑不限于蚊媒。鴨坦布蘇病毒為黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群中的坦布蘇病毒(Tembusu virus)。病毒的基因組為正股單鏈RNA,長約11 knt,基因組結(jié)構(gòu)為5'UTR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3'UTR。囊膜蛋白(E)是DTMUV主要的表面結(jié)構(gòu)蛋白,參與病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合,含有病毒的主要中和抗原表位。DTMUVNS1蛋白參與病毒的組裝,也可以二聚體或六聚體的形式分泌至胞外,拮抗宿主的先天性免疫。E蛋白和NS1蛋白為DTMUV的2個最主要免疫保護性抗原,關(guān)于其抗原表位信息報道較少。本研究分離鑒定了一株鴨源坦布蘇病毒,研究其生物學(xué)特性,測定其全基因序列,分析其基因進化特征。應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備了 4株抗DTMUV E蛋白和NS1蛋白的單克隆抗體,其中針對E蛋白的單克隆抗體能區(qū)分DTMUV和日本腦炎病毒(JEV)抗原,DTMUV囊膜蛋白特異抗原表位的發(fā)現(xiàn)為DTMUV血清學(xué)診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。具體研究如下:1鴨坦布蘇病毒XZ-2012株的分離鑒定與基因變異分析2012年10月徐州地區(qū)某鴨場爆發(fā)了櫻桃谷種鴨產(chǎn)蛋驟然下降的疫病,患病鴨表現(xiàn)為發(fā)熱、采食減少、產(chǎn)蛋下降,剖檢可見脾腫大、卵泡出血、萎縮等。本研究從送檢病料中分離到一株鴨坦布蘇病毒,命名為DTMUV XZ-2012株。DTMUV XZ-2012株能適應(yīng)雞胚培養(yǎng),于BHK-21細(xì)胞上第5代的病毒滴度為5×104 PFU/mL。應(yīng)用RT-PCR的方法擴增DTMUV XZ-2012基因,測序發(fā)現(xiàn)其基因組全長為10990nt,編碼的多聚蛋白有3426個氨基酸。DTMUV XZ-2012株與文獻報道的BYD株、YY5株、JS_2010株等DTMUV的全基因同源性為98.5%-99.3%。與國內(nèi)最初分離的DTMUV BYD株等相比,DTMUV XZ-2012的基因變異主要分布于E基因、NS1基因和NS2a基因,提示該病毒在自然界的流行存在一定的免疫壓力。2鴨坦布蘇病毒EDⅢ蛋白單克隆抗體的制備與特性鑒定用純化的鴨坦布蘇病毒重組EDⅢ蛋白免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體,共獲得2株能穩(wěn)定分泌抗鴨坦布蘇病毒EDⅢ抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為3C4和3D12。經(jīng)間接ELISA測定,2株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價均為1:12800。腹水效價分別為1×105和2×105。單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果顯示,3C4株單抗的亞類為IgG1κ型,3D12株單抗的亞類為IgG2bK型。間接免疫熒光試驗與Westernblot鑒定結(jié)果表明3C4、3D12株雜交瘤細(xì)胞能特異性識別細(xì)胞中鴨坦布蘇病毒的EDⅢ蛋白,與日本腦炎病毒沒有交叉反應(yīng)。中和試驗顯示這兩株單抗沒有中和活性。3鴨坦布蘇病毒NS1蛋白單克隆抗體的制備利用純化的鴨坦布蘇病毒NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體,共獲得2株能穩(wěn)定分泌抗鴨坦布蘇病毒NS1蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2F6和2F12。經(jīng)間接ELISA測定,2株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價分別為1:6400、1:12800。腹水效價均為1:1×105。單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果顯示,2F6、2F12株單抗的亞類均為IgG1,2株單抗的輕鏈均為κ型。Western blot與間接免疫熒光試驗鑒定結(jié)果表明2F6、2F12株雜交瘤細(xì)胞能特異性識別DTMUV接種細(xì)胞中的NS1蛋,2F12與日本腦炎病毒接種細(xì)胞有交叉反應(yīng),2F6與JEVNS1沒有交叉反應(yīng)。4鴨坦布蘇病毒EDⅢ蛋白B細(xì)胞表位的鑒定為了對獲得的2株抗鴨坦布蘇病毒EDⅢ蛋白的單克隆抗體所針對的抗原表位進行精確定位,本研究通過原核表達了截短的EDⅢ蛋白,人工合成了多肽抗原。通過ELISA和Western blot方法精確定位了這兩株單克隆抗體所識別的抗原表位。結(jié)果顯示這兩株囊膜蛋白單克隆抗體針對的是同一表位310SLVKNP315。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該表位高度保守,且與其他黃病毒不交叉。以上結(jié)果豐富了鴨坦布蘇病毒EDⅢ蛋白抗原表位圖譜,為EDⅢ蛋白相關(guān)功能的進一步研究和鴨坦布蘇病毒鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：1498338