發(fā)布時間：2018-01-29 02:11

  本文關鍵詞： 豬血凝性腦脊髓炎 N蛋白 單克隆抗體 雙抗夾心ELISA 試劑盒　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：豬血凝性腦脊髓炎(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染豬后引起的一種以嘔吐、衰竭和顯著神經(jīng)癥狀為臨床特征的急性、高度接觸性傳染病。成年豬多呈隱性感染。但3周齡以內(nèi)的仔豬尤為易感,一旦發(fā)病,死亡率最高可達100%。目前針對PHE的診斷方法有多種,但有的需要大型儀器設備、有的容易出現(xiàn)假陽性或敏感性不夠,使得這些方法不利于在臨床上對疫情做出快速準確的診斷,在疫情緊急時,甚至阻礙了該病防治工作的快速進行。所以,本實驗通過制備PHEV N蛋白單克隆抗體及其多克隆抗體,成功構(gòu)建并組裝雙抗夾心ELISA抗原診斷試劑盒并初步用于臨床檢測,旨在幫助基層養(yǎng)殖戶在疫情發(fā)生或流行時做出準確及時的判定。具體研究內(nèi)容如下:1.PHEV N蛋白基因大腸桿菌表達載體的構(gòu)建及N蛋白的純化根據(jù)N蛋白基因序列,使用Primer5.0設計N蛋白表達引物。將該基因片段克隆至原核表達載體p ET-28a,成功構(gòu)建重組表達載體p ET-28a-N。再將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(BL21)中,經(jīng)過IPTG誘導、SDS-PAGE和Western-blot鑒定,獲得大小為55KDa的重組蛋白N。用Ni-NTA親和層析進行重組蛋白的純化后測定蛋白濃度,獲得重組N蛋白濃度為:1659.3ug/m L、1139.1ug/m L和726.8ug/m L。2.PHEV單克隆抗體的制備將純化的重組N蛋白,對6~8周齡健康Balb/c小鼠背部皮下多點注射,進行免疫。四次免疫之后,ELISA檢測小鼠血清抗體效價,P/N2.1時,取小鼠脾細胞與培養(yǎng)好的SP2/0細胞進行融合,用間接ELISA方法對融合后的細胞進行篩選。獲得四株可穩(wěn)定分泌抗PHEV的單克隆抗體,并進行亞類鑒定,分別是2H2(Ig G1)、2A1(Ig G1)、1E2(Ig G2a)、4D4(Ig G1);四株效價均在1:12800~1:51200之間;經(jīng)Western blot分析,編號2A1可識別非結(jié)構(gòu)蛋白N;經(jīng)間接ELISA和間接免疫熒光鑒定,4株單抗均能與PHEV特異性結(jié)合。3.PHEV抗體陰性及陽性對照血清、兔抗PHEV多克隆抗體的制備將PHEV-67N標準毒株對健康家兔進行人工皮下注射,制備陽性對照血清及兔抗PHEV多克隆抗體。當ELISA檢測血清效價達到105以上,無菌采血并分離血清作為陽性對照血清,過濾除菌之后存于-20℃中。陰性對照血清采自健康6月齡家兔,采血并分離血清后,經(jīng)PCR及ELISA檢測血清PHEV抗體均為陰性。對兩份血清分別進行PEDV、TGEV、PCV2和PRV的ELISA檢測,結(jié)果均呈陰性。4.PHEV抗原捕獲ELISA檢測方法的建立、試劑盒的組裝及質(zhì)量檢測用制備的兔抗PHEV多克隆抗體包被酶標板,以抗N蛋白單克隆抗體作為檢測抗體,建立雙抗夾心ELISA檢測方法,并對其反應條件進行優(yōu)化:多抗最佳稀釋倍數(shù)為8000倍;單克隆抗體最佳工作濃度為0.5μg/m L;最佳封閉液是5%BSA,時間為2h;捕獲抗體(兔多抗)最佳包被時間為4℃過夜處理、檢測抗體(單抗)在37℃條件下孵育1h時效果最佳;顯色時間最佳為15min。經(jīng)過特異性、靈敏度試驗,結(jié)果顯示該方法特異性良好,無交叉反應;能夠檢測出的最低PHEV濃度為63.12ng/m L。根據(jù)建立的檢測方法,完成了對試劑盒的組裝,并對其質(zhì)量進行了評估:試劑盒批內(nèi)變異系數(shù)(CV%)介于4.8%~9.6%之間,批間變異系數(shù)(CV%)介于3.2%~8.9%之間,均小于10%,具有良好的重復性;通過37℃加速老化試驗,顯示試劑盒在4℃溫度下能夠密封保存6個月左右;應用組裝的ELISA試劑盒與實驗室建立的RT-PCR檢測方法分別對人工感染的小鼠和對吉林省范圍內(nèi)采集的200份疑似病豬進行檢測,結(jié)果顯示兩種方法陽性檢出總符合率都在90%以上。綜上所述,本實驗成功建立雙抗夾心ELISA檢測方法,完成了對ELISA檢測試劑盒的組裝與質(zhì)量評估。經(jīng)檢測,該試劑盒在靈敏度、重復性及穩(wěn)定性上均達到要求,為后期試劑盒的轉(zhuǎn)化和市場化應用奠定了堅實的基礎。
[Abstract]:The recombinant expression vector pET - 28a - N was cloned into E . coli BL21 . After four immunization , the recombinant expression vector pET - 28a - N was successfully constructed . The positive control serum and the rabbit anti - PHEV polyclonal antibody were detected by indirect ELISA and indirect immunofluorescence assay . In conclusion , the results showed that the total coincidence rate of the two methods was above 90 % . The results showed that the total coincidence rate of the two methods was above 90 % .

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.28

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