本文關(guān)鍵詞： 豬血凝性腦脊髓炎 N蛋白 單克隆抗體 雙抗夾心ELISA 試劑盒　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬血凝性腦脊髓炎(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染豬后引起的一種以嘔吐、衰竭和顯著神經(jīng)癥狀為臨床特征的急性、高度接觸性傳染病。成年豬多呈隱性感染。但3周齡以內(nèi)的仔豬尤為易感,一旦發(fā)病,死亡率最高可達(dá)100%。目前針對(duì)PHE的診斷方法有多種,但有的需要大型儀器設(shè)備、有的容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或敏感性不夠,使得這些方法不利于在臨床上對(duì)疫情做出快速準(zhǔn)確的診斷,在疫情緊急時(shí),甚至阻礙了該病防治工作的快速進(jìn)行。所以,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備PHEV N蛋白單克隆抗體及其多克隆抗體,成功構(gòu)建并組裝雙抗夾心ELISA抗原診斷試劑盒并初步用于臨床檢測(cè),旨在幫助基層養(yǎng)殖戶在疫情發(fā)生或流行時(shí)做出準(zhǔn)確及時(shí)的判定。具體研究?jī)?nèi)容如下:1.PHEV N蛋白基因大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建及N蛋白的純化根據(jù)N蛋白基因序列,使用Primer5.0設(shè)計(jì)N蛋白表達(dá)引物。將該基因片段克隆至原核表達(dá)載體p ET-28a,成功構(gòu)建重組表達(dá)載體p ET-28a-N。再將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(BL21)中,經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE和Western-blot鑒定,獲得大小為55KDa的重組蛋白N。用Ni-NTA親和層析進(jìn)行重組蛋白的純化后測(cè)定蛋白濃度,獲得重組N蛋白濃度為:1659.3ug/m L、1139.1ug/m L和726.8ug/m L。2.PHEV單克隆抗體的制備將純化的重組N蛋白,對(duì)6~8周齡健康Balb/c小鼠背部皮下多點(diǎn)注射,進(jìn)行免疫。四次免疫之后,ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià),P/N2.1時(shí),取小鼠脾細(xì)胞與培養(yǎng)好的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合,用間接ELISA方法對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行篩選。獲得四株可穩(wěn)定分泌抗PHEV的單克隆抗體,并進(jìn)行亞類鑒定,分別是2H2(Ig G1)、2A1(Ig G1)、1E2(Ig G2a)、4D4(Ig G1);四株效價(jià)均在1:12800~1:51200之間;經(jīng)Western blot分析,編號(hào)2A1可識(shí)別非結(jié)構(gòu)蛋白N;經(jīng)間接ELISA和間接免疫熒光鑒定,4株單抗均能與PHEV特異性結(jié)合。3.PHEV抗體陰性及陽(yáng)性對(duì)照血清、兔抗PHEV多克隆抗體的制備將PHEV-67N標(biāo)準(zhǔn)毒株對(duì)健康家兔進(jìn)行人工皮下注射,制備陽(yáng)性對(duì)照血清及兔抗PHEV多克隆抗體。當(dāng)ELISA檢測(cè)血清效價(jià)達(dá)到105以上,無(wú)菌采血并分離血清作為陽(yáng)性對(duì)照血清,過(guò)濾除菌之后存于-20℃中。陰性對(duì)照血清采自健康6月齡家兔,采血并分離血清后,經(jīng)PCR及ELISA檢測(cè)血清PHEV抗體均為陰性。對(duì)兩份血清分別進(jìn)行PEDV、TGEV、PCV2和PRV的ELISA檢測(cè),結(jié)果均呈陰性。4.PHEV抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立、試劑盒的組裝及質(zhì)量檢測(cè)用制備的兔抗PHEV多克隆抗體包被酶標(biāo)板,以抗N蛋白單克隆抗體作為檢測(cè)抗體,建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法,并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化:多抗最佳稀釋倍數(shù)為8000倍;單克隆抗體最佳工作濃度為0.5μg/m L;最佳封閉液是5%BSA,時(shí)間為2h;捕獲抗體(兔多抗)最佳包被時(shí)間為4℃過(guò)夜處理、檢測(cè)抗體(單抗)在37℃條件下孵育1h時(shí)效果最佳;顯色時(shí)間最佳為15min。經(jīng)過(guò)特異性、靈敏度試驗(yàn),結(jié)果顯示該方法特異性良好,無(wú)交叉反應(yīng);能夠檢測(cè)出的最低PHEV濃度為63.12ng/m L。根據(jù)建立的檢測(cè)方法,完成了對(duì)試劑盒的組裝,并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)估:試劑盒批內(nèi)變異系數(shù)(CV%)介于4.8%~9.6%之間,批間變異系數(shù)(CV%)介于3.2%~8.9%之間,均小于10%,具有良好的重復(fù)性;通過(guò)37℃加速老化試驗(yàn),顯示試劑盒在4℃溫度下能夠密封保存6個(gè)月左右;應(yīng)用組裝的ELISA試劑盒與實(shí)驗(yàn)室建立的RT-PCR檢測(cè)方法分別對(duì)人工感染的小鼠和對(duì)吉林省范圍內(nèi)采集的200份疑似病豬進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示兩種方法陽(yáng)性檢出總符合率都在90%以上。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功建立雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法,完成了對(duì)ELISA檢測(cè)試劑盒的組裝與質(zhì)量評(píng)估。經(jīng)檢測(cè),該試劑盒在靈敏度、重復(fù)性及穩(wěn)定性上均達(dá)到要求,為后期試劑盒的轉(zhuǎn)化和市場(chǎng)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant expression vector pET - 28a - N was cloned into E . coli BL21 . After four immunization , the recombinant expression vector pET - 28a - N was successfully constructed . The positive control serum and the rabbit anti - PHEV polyclonal antibody were detected by indirect ELISA and indirect immunofluorescence assay . In conclusion , the results showed that the total coincidence rate of the two methods was above 90 % . The results showed that the total coincidence rate of the two methods was above 90 % .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：1472214