本文關(guān)鍵詞： 褪黑素 精原干細(xì)胞 支持細(xì)胞 GDNF 繁殖季節(jié) 奶山羊　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：褪黑素是動(dòng)物松果體分泌的一種吲哚類激素,其分泌受光照的調(diào)節(jié),光照時(shí)間長(zhǎng),強(qiáng)度高,分泌多;光照時(shí)間短,強(qiáng)度低,分泌少。在我國(guó)北方地區(qū),每年的秋冬季節(jié)為奶山羊的繁殖季節(jié),褪黑素的分泌量大,雄性山羊的精液品質(zhì)高。在本實(shí)驗(yàn)中,我們采集了繁殖與非繁殖季節(jié)成年奶山羊的睪丸組織,組織切片HE染色發(fā)現(xiàn),繁殖季節(jié)奶山羊精子發(fā)生更加活躍,各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)目較多,自我更新和增殖相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)水平較高。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),在精子發(fā)生的各級(jí)生精細(xì)胞中均存在褪黑素的受體,在繁殖季節(jié)其受體的表達(dá)水平高。這些結(jié)果表明雄性奶山羊存在季節(jié)性繁殖現(xiàn)象,且褪黑素可能參與引起季節(jié)性繁殖現(xiàn)象。研究認(rèn)為,動(dòng)物的繁殖行為主要是依靠下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控,而褪黑素在其中發(fā)揮重要作用,褪黑素可以直接或間接作用于下丘腦,垂體以及生殖細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)激素的分泌以及精子發(fā)生和卵子發(fā)生。精原干細(xì)胞是存在于曲細(xì)精管基底膜的一類具有自我更新和分化為精子能力的細(xì)胞,是精子發(fā)生過(guò)程中的“起始細(xì)胞”,為了研究褪黑素是否通過(guò)精原干細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)精子發(fā)生進(jìn)而參與季節(jié)性繁殖的形成,本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)奶山羊精原干細(xì)胞,并用褪黑素予以干預(yù),得到以下結(jié)果:1.采用Ⅳ型膠原酶和胰蛋白酶結(jié)合消化法分離奶山羊睪丸組織細(xì)胞,經(jīng)過(guò)差速貼壁法富集,利用奶山羊精原干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得奶山羊精原干細(xì)胞克隆,克隆呈CD49f、GFRa1、PGP9.5陽(yáng)性,堿性磷酸酶弱陽(yáng)性,同時(shí)在mRNA和蛋白水平表達(dá)精原干細(xì)胞標(biāo)記PLZF,說(shuō)明培養(yǎng)體系適用于奶山羊精原干細(xì)胞的培養(yǎng)。2.通過(guò)對(duì)細(xì)胞活力和增殖相關(guān)標(biāo)記檢測(cè)以及細(xì)胞克隆大小判斷,發(fā)現(xiàn)褪黑素可以促進(jìn)奶山羊精原干細(xì)胞的增殖。對(duì)支持細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn),褪黑素也可以促進(jìn)支持細(xì)胞的標(biāo)記SOX9和GDNF的表達(dá),對(duì)精原干細(xì)胞分化標(biāo)記基因Stra8,Dazl、Kit和Sycp3檢測(cè)發(fā)現(xiàn),褪黑素抑制精原干細(xì)胞的分化。而利用CCK-8,MTT以及Brdu染色發(fā)現(xiàn),褪黑素對(duì)mGSCs-I-SB細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。3.Elisa檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在體外培養(yǎng)奶山羊精原干細(xì)胞時(shí),支持細(xì)胞可以產(chǎn)生GDNF來(lái)維持精原干細(xì)胞的增殖和自我更新。加入褪黑素以后,上清液中的GDNF含量明顯升高,這說(shuō)明褪黑素可以刺激支持細(xì)胞產(chǎn)生GDNF,繼而促進(jìn)奶山羊精原干細(xì)胞的增殖和自我更新。Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GDNF是通過(guò)激活A(yù)KT和ERK1/2的磷酸化水平進(jìn)行增殖和自我更新,且以p-ERK1/2的激活為主,加入褪黑素以后磷酸化的水平更高,這進(jìn)一步說(shuō)明褪黑素是通過(guò)GDNF這條通路促進(jìn)山羊精原干細(xì)胞的增殖。通過(guò)體外褪黑素對(duì)奶山羊精原干細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn),我們認(rèn)為繁殖季節(jié)奶山羊體內(nèi)褪黑素生成較多,可以刺激支持細(xì)胞產(chǎn)生更多的GDNF,進(jìn)而促進(jìn)奶山羊精原干細(xì)胞的增殖和自我更新,以維持精原干細(xì)胞池的穩(wěn)定。精子發(fā)生的調(diào)節(jié)還有其他多種激素的參與,在它們共同作用下形成了短日照動(dòng)物的季節(jié)性繁殖現(xiàn)象。
[Abstract]:In the northern part of China , it is found that melatonin may play an important role in the reproduction season of dairy goats , and melatonin may play an important role in the reproduction season . It was found that melatonin could stimulate the proliferation and self - renewal of spermatogonial stem cells in milk goat . After addition of melatonin , it was found that melatonin could stimulate the proliferation and self - renewal of spermatogonial stem cells .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：1471840