本文關(guān)鍵詞： 小反芻獸疫 小反芻獸疫病毒 H基因 H蛋白 線性B細(xì)胞表位篩選　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：小反芻獸疫(PPR)是由小反芻獸疫病毒(PPRV)感染山羊、綿羊等家養(yǎng)和野生小反芻動(dòng)物的一種烈性、接觸性、傳染性疫病。2007年,在我國(guó)西藏地區(qū)首次暴發(fā)小反芻獸疫。目前,我國(guó)已有20個(gè)省市相繼發(fā)現(xiàn)了感染病例。探索有效的快速診斷和防治相結(jié)合的防治措施對(duì)于及時(shí)應(yīng)對(duì)隨時(shí)可能發(fā)生的小反芻獸疫疫情具有重要的意義。本研究利用蛋白質(zhì)免疫印跡方法,以免疫的新西蘭大白兔血清為一抗,通過(guò)覆蓋H基因的重疊16肽片段與血清的特異性反應(yīng),鑒定小反芻獸疫病毒H蛋白的線性B細(xì)胞表位。本文主要進(jìn)行了以下研究:1.PPRV H基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建以密碼子優(yōu)化的Peste des petits ruminants virus strain China/Tibet/Geg/07-30(FJ905304)的H基因?yàn)槟０?擴(kuò)增H基因片段,構(gòu)建了1個(gè)克隆載體pJET1.2/blunt-PPRV-H和3個(gè)表達(dá)載體pET28a-PPRV-H,pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H。2.His-H蛋白的表達(dá)與純化對(duì)重組表達(dá)載體pET30a-PPRV-H的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定濃度為1mmol/L IPTG,誘導(dǎo)5 h為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。在此條件下,H蛋白主要以包涵體形式存在。通過(guò)尿素溶液洗滌包涵體,去除雜蛋白,純化和濃縮目的蛋白,濃縮后的蛋白濃度最高為2 mg/mL。3.免疫血清的制備以純化后的重組H蛋白免疫新西蘭大白兔(0.5 mg/只),分別在14 d、28d、42 d加強(qiáng)免疫一次,56 d頸動(dòng)脈采血收集血清。通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定血清的滴度,1號(hào),2號(hào)和3號(hào)兔子免疫血清的滴度分別達(dá)到1∶25600,1∶12800,1∶6400。從而說(shuō)明獲得的抗血清可以特異性識(shí)別重組表達(dá)的His-H蛋白。4.H蛋白B細(xì)胞線性表位的篩選設(shè)計(jì)并合成覆蓋H基因16肽的基因序列,構(gòu)建表達(dá)載體pXXGST-3-P76-(1F~75F),將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。以兔抗H蛋白抗血清作為一抗,利用蛋白質(zhì)免疫印跡來(lái)篩選重組表達(dá)的16肽片段,從而確定H蛋白的線性B細(xì)胞表位,結(jié)果共篩選出30個(gè)陽(yáng)性的16肽。
[Abstract]:Ruminant ruminant disease (PPRV) is a strong, contagious, infectious disease of small ruminants infected by small ruminant virus (PPRV) in goats, sheep and other domestic and wild ruminants. 2007. The first outbreak of small ruminant epidemic in Tibet, China. 20 provinces and cities in China have found infected cases one after another. It is of great significance to explore effective prevention and treatment measures combining rapid diagnosis and prevention and treatment for the possible small ruminant epidemic situation at any time. Western blotting was used. The immunized New Zealand white rabbit serum was used as the first antibody, and the specific reaction between the 16 peptide fragment and the serum was obtained by covering the H gene. The linear B cell epitopes of ruminant ruminant virus H protein were identified. In this paper, the following studies were carried out: 1. Construction of a prokaryotic expression vector of PPRVH gene with codon optimized Peste des. Petits ruminants virus strain China / beta / Gegr / 07-30. FJ905304) the H base because of the template. The H gene fragment was amplified and a clone vector pJET1.2/blunt-PPRV-H and three expression vectors pET28a-PPRV-H were constructed. Expression and purification of pET30a-PPRV-H and pET32a-PPRV-H.2.His-H protein to induce expression of Recombinant expression Vector pET30a-PPRV-H. To optimize. The optimal expression conditions were determined to be 1 mmol / L IPTG and induced for 5 h. Under these conditions, the protein mainly existed in the form of inclusion body, and the inclusion body was washed by urea solution. Remove miscellaneous proteins, purify and concentrate target proteins. The concentration of concentrated protein was up to 2 mg / mL 路3.The purified recombinant H protein was used to immunize New Zealand white rabbits with 0.5 mg / L for 14 days and 28 days respectively. The serum was collected from carotid artery for 56 days after 42 days of enhanced immunization. The titer of serum was determined by indirect ELISA method. The titers of 2 and 3 rabbits were 1: 25600 and 1: 12800, respectively. 1:. The results showed that the obtained antiserum could specifically identify the recombinant His-H protein .4.4. the screening of linear epitopes of B cells and synthesis of the gene sequence covering the 16 peptide of H gene. To construct the expression vector pXXGST-3-P76-P76-P76-P76-P76-P76-P76-P76-P76-P76-F7 / 75FN, the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21. Western blot was used to screen the recombinant 16 peptide fragments, and then the linear B cell epitopes of H protein were determined. A total of 30 positive 16 peptides were screened out.
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1470297