本文關(guān)鍵詞： 蓋他病毒 E2基因 原核表達(dá) RT-PCR　出處：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：蓋他病毒(Getah virus, GETV)屬于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員,它通過蚊蟲叮咬脊椎動(dòng)物的方式來傳播疾病。GETV在豬群中流行會(huì)危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè),它被認(rèn)為是引起母豬繁殖障礙的原因之一。GETV能引起母豬繁殖障礙,新生仔豬輕度發(fā)熱、皮疹,后腿水腫且伴有精神沉郁和腹瀉。到目前為止對(duì)GETV所引起的疾病仍然沒有十分有效的治療藥物和疫苗。因此,建立特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的檢測方法就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)參考GenBank (EU015066) Getah virus SH05-6中結(jié)構(gòu)蛋白E2的全基因組序列,對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化后人工合成該基因。將合成的E2基因克隆至原核表達(dá)載體pCold I中,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold I-E2。通過對(duì)重組質(zhì)粒pCold I-E2進(jìn)行1PTG低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá),SDS-PAGE和Western Blot分析,結(jié)果可見在相對(duì)分子質(zhì)量46KD處出現(xiàn)目的條帶,與預(yù)期相符,且蛋白表達(dá)量占大腸桿菌表達(dá)總量的80%,E2基因在大腸桿菌低溫表達(dá)系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)。對(duì)E2蛋白進(jìn)行純化,并優(yōu)化了純化條件,最終獲得了高純度的蓋他病毒E2蛋白,并且制備了抗E2蛋白多克隆抗體。以E2基因?yàn)槟０?設(shè)計(jì)特異性引物,優(yōu)化反應(yīng)條件,初步建立了用于檢測GETV的RT-PCR方法,使用該方法檢測蚊蟲體內(nèi)所攜帶的GETV。檢測結(jié)果顯示從上海地區(qū)所采集的蚊蟲體內(nèi)并未檢測到GETV。本實(shí)驗(yàn)對(duì)我國GETV快速診斷技術(shù)的研究和發(fā)展具有重要推動(dòng)作用。
[Abstract]:Getah virus (GETV) is a member of the family TogaviridaeA belonging to Alphavirus. It spreads the disease through mosquitoes biting vertebrates. GETV is prevalent among pigs and can harm the pig industry. It is considered to be one of the causes of reproductive disorders in sows. GETV can cause reproductive disorders in sows, mild fever and rash in newborn piglets. Hind leg edema accompanied by depression and diarrhea. So far the disease caused by GETV is still not very effective treatment drugs and vaccines. Therefore, the establishment of a strong specificity. The accuracy of the detection method is particularly important. This experiment refers to GenBank / EU015066). The whole genome sequence of structural protein E2 in Getah virus SH05-6. The synthesized E2 gene was cloned into prokaryotic expression vector pCold I after codon optimization. The recombinant plasmid pCold I-E2 was successfully constructed. The recombinant plasmid pCold I-E2 was expressed by 1PTG hypothermia induction protein. The results of SDS-PAGE and Western Blot analysis showed that the target band appeared at 46KD relative molecular weight, which was consistent with the expectation. The E2 gene of 80% of the total expression amount of E. coli was highly expressed in the low temperature expression system of Escherichia coli. The E2 protein was purified and the purification conditions were optimized. Finally, a high purity E2 protein of capsid virus was obtained, and the polyclonal antibody against E2 protein was prepared. Using E2 as template, specific primers were designed to optimize the reaction conditions. A RT-PCR method for detecting GETV was preliminarily established. This method was used to detect the GETV carried in mosquitoes. The results showed that no GETV was detected in mosquitoes collected from Shanghai area. The study on the rapid diagnosis of GETV in China was conducted in this experiment. The exhibition plays an important role in promoting it.
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1464579