本文關(guān)鍵詞： 弓形蟲(chóng) ELISA 膠體金 GRA7　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：弓形蟲(chóng)病是由弓形蟲(chóng)引起的一種世界范圍流行的人獸共患寄生蟲(chóng)病,幾乎能感染所有溫血?jiǎng)游锛安糠掷溲獎(jiǎng)游?宿主范圍廣泛。該病一方面會(huì)引起妊娠階段孕婦流產(chǎn),胎兒畸形、先天性缺陷或死胎,造成嚴(yán)重后果;另一方面還會(huì)導(dǎo)致艾滋病患者、癌癥患者等免疫力低下人群出現(xiàn)心肌炎、肺炎或致死性腦炎等。人主要通過(guò)攝入含有弓形蟲(chóng)包囊的未煮熟的動(dòng)物肉類(lèi)及被弓形蟲(chóng)卵囊污染的水果、蔬菜、飲用水而感染弓形蟲(chóng)。因此,對(duì)動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染的監(jiān)控與預(yù)防可有效控制弓形蟲(chóng)的傳播流行。犬在弓形蟲(chóng)的生活史中扮演著重要角色,首先,犬可通過(guò)接觸貓糞便而將弓形蟲(chóng)卵囊攜帶至人類(lèi)生活區(qū);其次,如果人類(lèi)食入含有包囊的犬肉則會(huì)有感染弓形蟲(chóng)的可能。目前,弓形蟲(chóng)病臨床血清學(xué)診斷方法主要有改良凝集試驗(yàn)(MAT)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等,這些方法具有較好的敏感性和特異性,但是需要在實(shí)驗(yàn)室條件下完成,且需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)儀器、器材,實(shí)驗(yàn)要求高,不適合野外環(huán)境下檢測(cè)。而免疫膠體金法作為新興的快速檢測(cè)方法完全有潛力承擔(dān)并完成快速、簡(jiǎn)便的弓形蟲(chóng)病診斷任務(wù)。研究目的:原核致密顆粒蛋白GRA1、GRA7重組蛋白,建立間接ELISA方法檢測(cè)犬弓形蟲(chóng)抗體,并與蟲(chóng)體裂解蛋白TLA比較評(píng)價(jià),選出較優(yōu)蛋白。利用該蛋白制備兔抗多克隆抗體,進(jìn)而建立免疫膠體金快速檢測(cè)方法,檢測(cè)犬弓形蟲(chóng)抗體,為弓形蟲(chóng)病快速診斷提供方法。研究?jī)?nèi)容:1原核表達(dá)弓形蟲(chóng)重組蛋白GRA1、GRA7,建立犬弓形蟲(chóng)抗體間接ELISA方法,選出較優(yōu)重組蛋白抗原,用于進(jìn)一步研究;2用選出的重組蛋白制備抗體、純化濃縮驗(yàn)證多抗反應(yīng)性;3制備犬弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)試紙條,并進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究方法:1弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白GRA1、GRA7的表達(dá)與純化將實(shí)驗(yàn)室保種的含有重組質(zhì)粒p ET28-GRA1的大腸桿菌DE3菌株及含有重組質(zhì)粒p ET28-GRA7的大腸桿菌DE3搖床培養(yǎng)擴(kuò)增,收取菌體,用不可溶蛋白提取液裂解提取目的蛋白。將提取蛋白跑SDS-PAGE后驗(yàn)證蛋白大小,并將目的蛋白做Western Blot驗(yàn)證反應(yīng)性后,透析、濃縮目的蛋白,稀釋至1mg/m L,-20℃保存。2弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體裂解抗原TLA制備將液氮保存蟲(chóng)體復(fù)蘇接種Vero細(xì)胞后,收集弓形蟲(chóng)速殖子,-80℃與室溫反復(fù)凍融3次后,超聲破碎,吸取上清稀釋至1mg/m L,-20℃保存。3犬弓形蟲(chóng)抗體間接ELISA方法的建立及評(píng)價(jià)分別將GRA1、GRA7、TLA蛋白按照5μg/m L,5μg/m L,10μg/m L包被酶標(biāo)板,包被過(guò)夜并用脫脂奶粉封閉1h,加入待檢犬血清孵育1h,HRP標(biāo)記羊抗犬二抗孵育1h,加入底物顯色20min,用2M硫酸終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀450nm測(cè)定OD值。將ELISA檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)方法MAT、IFA共同檢測(cè)結(jié)果比較,SAS統(tǒng)計(jì)分析,驗(yàn)證建立方法可行性。并用受試工作者曲線ROC分析ELISA檢測(cè)結(jié)果,評(píng)價(jià)方法穩(wěn)定性及統(tǒng)計(jì)分析敏感性、特異性。選出較優(yōu)蛋白用于制備金標(biāo)試紙條。4多克隆抗體制備將0.5m L的2mg/m L目的蛋白與等體積，

本文編號(hào)：1446185