本文關鍵詞： 輪狀病毒 NSP1 先天性免疫 RLRs 拮抗機制　出處：《黑龍江八一農(nóng)墾大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：輪狀病毒(Rotavirus,RV)是引起嬰幼兒和多種幼齡動物腹瀉的主要病原之一,全世界每年因感染RV而死亡嬰幼兒達50~60萬。RV是人獸共患的病原體,目前尚無特效治療藥物,疫苗是預防該病的最主要手段。美國NIH基于改良的“琴納”原理以牛RV為親本研制的人-牛重配疫苗在非洲等地進行的臨床試驗發(fā)現(xiàn)該疫苗免疫效力尚不足50%,目前研究發(fā)現(xiàn)RV具有多重拮抗宿主先天性免疫的功能,疫苗免疫效力較低可能與宿主先天性免疫反應有關。RV NSP1是拮抗宿主先天性免疫的關鍵蛋白,具有多重功能。細胞質(zhì)模式識別受體RIG-I樣受體(RIG-I like receptors,RLRs)能夠識別病毒雙鏈RNA,激活下游干擾素調(diào)節(jié)因子,促進I型IFN分泌,產(chǎn)生先天性免疫應答。本實驗以牛RV UK株為研究對象,在RNA和蛋白水平上探討RV對人結腸腺癌細胞Caco-2的RLRs信號轉(zhuǎn)導通路部分關鍵因子的作用機制以及NSP1蛋白對人胚胎腎細胞293T的RLRs信號轉(zhuǎn)導通路部分關鍵因子在蛋白水平的影響。首先分別在RV UK株感染Caco-2細胞6 h、12 h和24 h后,提取總RNA,通過實時定量PCR檢測RIG-I、MDA5、IRF3、IRF7及RV VP6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。結果發(fā)現(xiàn)VP6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨轉(zhuǎn)染時間延長而逐漸上升,IRF3、IRF7、RIG-I和MDA5mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨感染時間延長表達量均略有上升,且感染早期RIG-I和MDA5相對有較明顯變化。結果表明RV UK株感染激活人源細胞RLRs信號轉(zhuǎn)導通路,產(chǎn)生宿主先天性免疫應答。另外,RV UK株感染Caco-2細胞,分別在6 h、12 h和24 h后收集細胞,通過Western blot檢測細胞內(nèi)源性IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量變化,發(fā)現(xiàn)IRF3蛋白含量隨感染時間延長逐漸下降,RIG-I和MDA5蛋白含量隨感染時間延長略有上升,表明RV UK株介導IRF3蛋白降解。為探討在蛋白水平上NSP1蛋白對先天性免疫RLRs信號轉(zhuǎn)導通路部分關鍵因子的影響,構建了pCMV-3×FLAG-NSP1真核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細胞,分別在轉(zhuǎn)染后4 h、8 h和12 h收集細胞,檢測細胞內(nèi)源性IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量變化。結果發(fā)現(xiàn)IRF3蛋白含量隨轉(zhuǎn)染時間延長而下降,RIG-I和MDA5蛋白無明顯變化。同時構建缺失IRF3結合結構域的pCMV-3×FLAG-NSP1△IRF3真核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細胞,分別在轉(zhuǎn)染后4 h、8 h和12 h收集細胞,檢測細胞內(nèi)源性IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量變化。結果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)源性IRF3、RIG-I和MDA5隨轉(zhuǎn)染時間延長均無明顯變化。構建pEGFP-C2-RIG-I、pEGFP-C2-MDA5和pEGFP-N3-IRF3真核表達質(zhì)粒,分別與p CMV-3×FLAG-NSP1真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,分別在轉(zhuǎn)染后4 h、8 h和12 h收集細胞,檢測IRF3、RIG-I和MDA5蛋白含量變化,發(fā)現(xiàn)IRF3蛋白含量隨轉(zhuǎn)染時間延長而下降,RIG-I和MDA5蛋白含量隨轉(zhuǎn)染時間延長而上升,進一步表明NSP1蛋白介導IRF3蛋白降解。在轉(zhuǎn)染之前,通過蛋白酶體抑制劑MG132預處理293T細胞1 h,pCMV-3×FLAG-NSP1質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染組內(nèi)源性IRF3蛋白含量未發(fā)生明顯變化;pCMV-3×FLAG-NSP1與pEGFP-N3-IRF3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組中NSP1和IRF3蛋白含量均隨轉(zhuǎn)染時間延長而上升,表明NSP1是依賴蛋白酶體途徑介導IRF3蛋白降解。實驗結果表明,RV UK株感染Caco-2細胞后,細胞模式識別受體RIG-I和MDA5識別出RV,表達量上升,誘導RLRs信號轉(zhuǎn)導通路激活,產(chǎn)生宿主先天性免疫應答,但RV NSP1蛋白介導下游信號分子IRF3的降解,一定程度上拮抗宿主先天性免疫應答,且NSP1是通過蛋白酶體依賴的途徑介導IRF3蛋白的降解,并需要其IRF3結合結構域的參與。通過RV UK株對人源宿主先天性免疫RLRs信號轉(zhuǎn)導通路拮抗機制的研究,為探討以其為親本的重配疫苗免疫效果不理想的原因提供依據(jù),為研制通過弱化NSP1介導降解IRF3和依賴蛋白酶體功能的新型重組疫苗和靶向藥物提供方向,為該毒株分子生物學研究提供理論參考。
[Abstract]:RF3 , IRF7 , IRF3 , IRF7 and RV VP6 mRNA transcript levels of human colon adenocarcinoma cell Caco - 2 were detected by means of real - time quantitative PCR . The results showed that NSP1 and MDA5 protein levels decreased with the time of transfection .

【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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