本文關(guān)鍵詞：屎腸球菌HDRsEf1調(diào)節(jié)IPEC-J2細胞炎癥反應(yīng)機制研究　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：屎腸球菌是公認的益生乳酸菌,具有改善宿主腸道健康、促進生長、降低腹瀉及免疫調(diào)節(jié)等作用。目前,有關(guān)屎腸球菌益生機理研究較少,尤其是其炎癥調(diào)節(jié)機制。本論文通過體外試驗,研究屎腸球菌HDRsEf1菌株對IPEC-J2細胞炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機制。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:試驗1屎腸球菌HDRsEf1對IPEC-J2細胞的影響。(1)粘附試驗。分別將HDRsEf1或者產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic e.coli,ETEC)K88ac與培養(yǎng)10天后的IPEC-J2細胞共孵育,檢測各自的粘附率。接下來檢測HDRsEf1菌體和其培養(yǎng)上清對K88ac粘附的影響。實驗過程如下:IPEC-J2細胞與HDRsEf1和K88ac共孵育,或者IPEC-J2細胞先與HDRsEf1共孵育,再與K88ac共孵育,或者IPEC-J2細胞先與K88ac共孵育,再與HDRsEf1共孵育,分別檢測K88ac的粘附率。HDRsEf1培養(yǎng)上清(S-Ef1)對K88ac粘附的影響的操作和菌體類似。結(jié)果顯示HDRsEf1比K88ac更易粘附于IPEC-J2細胞,且HDRsEf1菌體能夠通過競爭、排斥和置換作用阻止K88ac粘附IPEC-J2細胞,其粘附抑制率分別為46%(P0.05),11%(P0.05),61%(P0.05),表明HDRsEf1置換致病菌的效果較好。此外,實驗證明S-Ef1對K88ac的粘附幾乎沒有影響。(2)屎腸球菌HDRsEf1對IPEC-J2細胞完整性的影響。IPEC-J2細胞培養(yǎng)10天后,能夠分化完全,形成完整的膜結(jié)構(gòu),可以開始試驗。首先,我們用HDRsEf1及其S-Ef1預(yù)處理細胞2h,之后更換新鮮的完全培養(yǎng)基,再加入K88ac,在3、6、12h測量其跨膜電阻(TEER)。結(jié)果顯示HDRsEf1及其S-Ef1能夠保護IPEC-J2細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性,并能緩解K88ac對IPEC-J2細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞。(3)屎腸球菌HDRsEf1對IPEC-J2細胞分泌IL-8的調(diào)節(jié)作用。首先,用HDRsEf1及其S-Ef1預(yù)處理細胞2h,之后更換新鮮的完全培養(yǎng)基,再加入誘炎因子K88ac、IL-1β、TNF-ɑ處理細胞,之后檢測IL-8的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDRsEf1及其S-Ef1都能夠緩解誘炎因子K88ac、IL-1β、TNF-ɑ誘導(dǎo)的IL-8的表達。為了了解HDRsEf1發(fā)揮炎性調(diào)節(jié)作用的成分,將HDRsEf1及其S-Ef1加熱處理,并將其提取S-Ef1中的蛋白和胞外多糖,然后進行抑炎試驗。首先分別用滅活HDRsEf1、滅活S-Ef1、S-Ef1中蛋白、胞外多糖預(yù)處理IPEC-J2細胞2h,之后加入K88ac作用2h。結(jié)果表明熱處理對HDRsEf1及S-Ef1的抑炎效果沒有影響,S-Ef1中的胞外多糖具有抑炎作用,而S-Ef1中的蛋白沒有抑炎作用。試驗2屎腸球菌HDRsEf1胞外多糖的分離純化。試驗證明HDRsEf1具有產(chǎn)胞外多糖的性能,將HDRsEf1接種在脫脂乳培養(yǎng)基中30oC培養(yǎng)30h,其精提胞外多糖產(chǎn)量可達320mg/m L左右。將粗提胞外多糖用DEAE-Toyopearl 650M離子交換層析分離得到中性多糖(NPS)和酸性多糖(APS),將NPS和APS分別經(jīng)過Sephadex G-100和Sepharose CL-6B純化,得到純的NPS和APS。試驗3 HDRsEf1及其胞外多糖調(diào)節(jié)IPEC-J2細胞炎癥反應(yīng)信號通路研究。首先檢測HDRsEf1及其胞外多糖對細胞的毒性作用,證實HDRsEf1及其兩種多糖對IPEC-J2細胞沒有毒性,且都能提高IPEC-J2細胞的活性。接著,驗證HDRsEf1及其兩種多糖的炎癥調(diào)節(jié)作用,結(jié)果顯示HDRsEf1及其兩種多糖都能緩解LPS誘導(dǎo)的腸上皮細胞的炎性反應(yīng)。接下來,試驗HDRsEf1及其兩種多糖是否通過TLR2和TLR4兩種受體發(fā)揮抑炎作用,以LPS誘導(dǎo)IPEC-J2炎癥模型,采用抗體中和試驗TLR2和TLR4在HDRsEf1及其兩種多糖在炎癥調(diào)節(jié)中的作用,結(jié)果顯示,TLR2在HDRsEf1的炎癥調(diào)節(jié)中起重要的作用;TLR2和TLR4在兩種多糖的炎癥調(diào)節(jié)中都發(fā)揮重要的作用。為進一步弄清HDRsEf1及其兩種多糖對TLR的炎癥調(diào)節(jié)機制,檢測了HDRsEf1和其兩種多糖對TLR信號通路中相關(guān)負調(diào)節(jié)因子表達的影響。結(jié)果顯示TLR負調(diào)節(jié)因子Tolliop,IRAKM,A20,Bcl-3在HDRsEf1的炎性調(diào)節(jié)中起重要的作用;TLR負調(diào)節(jié)因子SIGIRR,Tolliop,IRAKM,A20,Bcl-3在NPS的炎性調(diào)節(jié)中起重要的作用;TLR負調(diào)節(jié)因子Tolliop,A20,Mkp-1在APS的炎性調(diào)節(jié)中起重要作用。最后用Western Blot檢測了HDRsEf1和其兩種多糖對NF-κB、AP-1兩種核轉(zhuǎn)錄因子的影響,結(jié)果表明HDRsEf1、NPS、APS能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB、AP-1的活性從而起到炎性調(diào)節(jié)的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.6

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本文編號：1352444