本文關(guān)鍵詞：miR-122在苦馬豆素誘導(dǎo)山羊胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：microRNA(miRNA)是一種非編碼的小RNA,長(zhǎng)19~23個(gè)核苷酸,可以在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用�？囫R豆素(swainsonine,SW)為一種生物堿,是造成動(dòng)物瘋草病的主要毒素。SW可通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)山羊胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞(goat placental trophoblast cells,GTC)凋亡,但是SW誘導(dǎo)GTC凋亡的過(guò)程中是否有miRNA參與調(diào)控,miRNA在SW誘導(dǎo)GTC凋亡的過(guò)程中又有怎樣的作用尚需進(jìn)一步探究。本論文首先用SW誘導(dǎo)GTC凋亡,提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行miRNA測(cè)序,然后對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選差異表達(dá)較大的miRNA,研究其對(duì)SW誘導(dǎo)GTC凋亡的作用。研究取得如下結(jié)果。1.分別用0.8μg/mL、1.6μg/mL、2.4μg/mL、3.2μg/mL SW處理GTC 24 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的變化。結(jié)果顯示,不同濃度SW處理24 h后GTC的存活率分別為74.8%、61.8%、39.1%和25.2%;排除存活率過(guò)高和過(guò)低的0.8μg/mL與3.2μg/mL濃度,選用1.6μg/mL和2.4μg/mL的SW處理GTC 24 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率分別為35.46%和78%,表明2.4μg/mL的SW處理后GTC凋亡率更高;用2.4μg/mL的SW分別處理GTC 0 h、12 h、24 h、36 h、48 h,AO/EB染色,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),SW處理24 h后的細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的凋亡。因此,決定用2.4μg/mL的SW處理GTC 24 h后進(jìn)行microRNA測(cè)序。2.microRNA測(cè)序后,用去除污染的clean reads進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)的分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,miRNA的長(zhǎng)度主要分布在22nt,說(shuō)明樣品質(zhì)量合格。分析SW處理前后GTC miRNA表達(dá)譜的變化,共篩選出25個(gè)差異表達(dá)顯著的miRNA(fold change2,p0.05,表達(dá)量大于0.1),其中上調(diào)的miRNA有16個(gè),下調(diào)的miRNA有9個(gè)。再根據(jù)表達(dá)量大于1的原則從25個(gè)差異表達(dá)顯著的miRNA中選出3個(gè)上調(diào)的miRNA,4個(gè)下調(diào)的miRNA,用real-time PCR檢驗(yàn)其表達(dá)量的變化,其變化趨勢(shì)與miRNA測(cè)序結(jié)果一致,選取其中與凋亡相關(guān)的miR-122進(jìn)行深入研究。使用Mireap、Miranda和TargetScan三個(gè)軟件對(duì)25個(gè)差異表達(dá)顯著的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),取預(yù)測(cè)得到的交集作為miRNA靶基因預(yù)測(cè)的結(jié)果,共得到4777個(gè)靶基因。對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行GO和KEGG注釋和聚類(lèi)分析,得到51條富集顯著(p0.05)的KEGG通路。3.根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,篩選差異表達(dá)顯著且與凋亡相關(guān)的miR-122作為研究對(duì)象,研究其在SW誘導(dǎo)GTC凋亡過(guò)程中的調(diào)控作用。將miR-122 mimics或inhibitors及其相對(duì)應(yīng)的control分別轉(zhuǎn)染GTC,再用SW處理細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞活性、caspase-3活性以及細(xì)胞凋亡率。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-122導(dǎo)致GTC的細(xì)胞活性降低、caspase-3的活性增加,并促進(jìn)SW誘導(dǎo)的GTC凋亡;抑制miR-122表達(dá)則增加GTC的活性、降低caspase-3的活性,并抑制SW誘導(dǎo)的GTC凋亡,表明miR-122在SW誘導(dǎo)GTC凋亡的過(guò)程中起到促進(jìn)凋亡的作用。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,篩選與細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因,用雙熒光素酶和western blotting驗(yàn)證miR-122的靶基因。將靶基因的3′UTR克隆至雙熒光素酶質(zhì)粒psiCHECK-2,構(gòu)建含靶基因3′UTR結(jié)合位點(diǎn)的重組雙熒光素酶質(zhì)粒。將miR-122mimics與重組雙熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至GTC,檢測(cè)miR-122與靶基因3′UTR的結(jié)合活性,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-122后含有Bcl-w 3′UTR重組質(zhì)粒的細(xì)胞雙熒光素酶活性顯著降低。將miR-122 mimics或mimics control轉(zhuǎn)染至GTC,western blotting檢測(cè)Bcl-w蛋白水平,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-122后Bcl-w的蛋白表達(dá)量顯著降低,以上結(jié)果表明Bcl-w是miR-122的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)SW處理會(huì)引起GTCmiRNA表達(dá)譜發(fā)生變化且miR-122的表達(dá)量顯著下調(diào),證明了miR-122可以促進(jìn)SW誘導(dǎo)的GTC凋亡并驗(yàn)證了miR-122的靶基因?yàn)锽cl-w,闡明了miR-122在W誘導(dǎo)的GTC凋亡過(guò)程中的作用,為進(jìn)一步研究SW的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.3

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