本文關(guān)鍵詞：牛奶中支原體的檢測及牛支原體LAMP診斷方法的建立　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 支原體 奶樣 PCR 牛支原 LAMP

【摘要】：支原體是一類沒有細(xì)胞壁、具有多形性、能夠通過細(xì)菌濾器、目前已知最小的、可以在非細(xì)胞培養(yǎng)基中生長的、特殊的原核微生物,能夠引起人和動物的多種疾病,是一類重要的病原體。國外研究表明,支原體在奶牛乳房炎的發(fā)生方面具有重要的病原學(xué)地位,在美國和歐洲每年給奶牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前國內(nèi)奶牛支原體乳房炎相關(guān)研究開展得很少,支原體在我國奶牛場奶樣中的流行情況、流行的優(yōu)勢病原種類及其在奶牛乳房炎發(fā)生中的作用等都還不清楚。本研究擬采用支原體分子檢測和病原分離鑒定等技術(shù)手段,對我國多個(gè)地區(qū)奶牛場的奶樣進(jìn)行檢測和種類鑒定,初步探索支原體在奶牛場奶樣中的流行情況及其在奶牛乳房炎發(fā)病、流行中的作用。由于已報(bào)道可引起牛乳房炎的支原體種類較多且有可能存在未知支原體病原,為了篩選一種可靠的支原體屬特異性PCR方法作為初篩手段,本研究首先用實(shí)驗(yàn)室保存的17種55株支原體以及13種16株細(xì)菌病原體對5種已發(fā)表的支原體屬特異性PCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證、篩選,結(jié)果顯示方法4具有良好的特異性,能夠完全區(qū)分支原體與非支原體細(xì)菌。以牛支原體為擴(kuò)增對象,最低能夠檢出10 pg牛支原體基因組DNA以及濃度為100 ccu/mL的牛支原體培養(yǎng)物。利用該P(yáng)CR方法和支原體分離方法檢測人工感染牛支原體樣品和臨床采集樣品73份,二者符合率為93.15%。結(jié)果表明方法4可作為實(shí)驗(yàn)室支原體常規(guī)快速篩查方法。應(yīng)用篩選出的支原體屬特異性PCR方法對我國北京、寧夏、內(nèi)蒙等地區(qū)的10個(gè)奶牛場的1100份奶樣進(jìn)行了支原體初篩,結(jié)果隱性乳房炎樣407份,支原體陽性率為11.06%(45/407);臨床型乳房炎樣品49份,支原體陽性率為10.20%(5/49);臨床健康牛奶樣644份,支原體陽性率為8.54%(55/644);對陽性樣品進(jìn)一步利用幾種已報(bào)道的牛乳房炎支原體(牛支原體、牛生殖道支原體、加利福尼亞支原體、產(chǎn)堿支原體、牛鼻支原體)種特異性PCR,結(jié)果陽性樣品中98.06%(101/103)為牛支原體、1.94%(2/103)為產(chǎn)堿支原體,沒有檢測到其它支原體。這些結(jié)果表明我國奶牛奶樣中存在支原體流行,且優(yōu)勢支原體種類為牛支原體。為了能夠快速、簡便的檢測奶樣中的優(yōu)勢支原體——牛支原體,利用牛支原體uvrC基因?yàn)闄z測靶標(biāo),設(shè)計(jì)了一套LAMP引物,通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,建立了一種牛支原體特異性的LAMP檢測方法。對11種(12株)不同來源的支原體和4種(4株)牛源細(xì)菌進(jìn)行檢測,結(jié)果除了牛支原體外,其他病原均為陰性,表明本方法具有良好的特異性。敏感性試驗(yàn)顯示本方法最低能夠檢測1 pg的牛支原體基因組。本實(shí)驗(yàn)建立的牛支原體LAMP檢測方法,只需要在61℃保溫一個(gè)小時(shí)即可完成反應(yīng),反應(yīng)完成后加入SYBR GreenⅠ顯色液就能直接根據(jù)顏色變化用肉眼判斷檢測結(jié)果,是一種適合在基層推廣應(yīng)用的快速檢測牛支原體的輕簡化檢測方法。
[Abstract]:Mycoplasma is a kind of special prokaryotic microorganism, which has no cell walls, polymorphic, and can be found through bacterial filters, and is currently the smallest known and can grow in non cell culture medium. It can cause a variety of diseases of human and animal, and is an important pathogen. Foreign studies have shown that Mycoplasma has important etiological status in the occurrence of Dairy Mastitis, which brings huge economic losses to dairy cattle industry in the United States and Europe every year. But at present, there are few researches on Mycoplasma mastitis in China. The prevalence of Mycoplasma in dairy farms in China, the prevalent dominant pathogens and their role in the occurrence of mastitis in dairy cows are not clear. The purpose of this study was to isolate and identify the pathogen and molecular detection of Mycoplasma and other technical means, in many areas of China dairy milk samples were detected and identified, preliminary exploration of the epidemic situation of Mycoplasma in dairy milk samples and the incidence of mastitis in dairy cow in effect. As has been reported by many kinds of Mycoplasma mastitis and potentially unknown pathogenic mycoplasma, a reliable means of screening for Mycoplasma specific PCR as a screening method, this research first used the laboratory preserved 17 55 mycoplasma strains of Mycoplasma and 13 species and 16 strains of bacterial pathogens of 5 genera have been published the specificity of PCR method was verified, screening, 4 results show that the method has good specificity and can distinguish between bacterial and non Mycoplasma mycoplasma. With Mycoplasma bovine as the amplification object, 10 PG of Mycoplasma bovine genome DNA and 100 ccu/mL of bovine mycoplasma were detected. The PCR method and Mycoplasma separation method were used to detect 73 samples of Mycoplasma bovine infection and clinical samples, and the rate of compliance was 93.15% in two cases. The results show that method 4 can be used as a routine rapid screening method for Mycoplasma in laboratory. The application of the screened Mycoplasma genus specific PCR method for 10 cows in Beijing, Ningxia, Inner Mongolia and other areas in the field of 1100 milk samples were Mycoplasma screening results of subclinical mastitis in 407 samples, the positive rate of Mycoplasma was 11.06% (45/407); clinical mastitis in 49 samples, the positive rate of Mycoplasma was 10.20% (5/49); clinical health milk 644 samples, the positive rate of Mycoplasma was 8.54% (55/644); the positive samples were further use of several reported bovine mastitis (bovine mycoplasma mycoplasma and Mycoplasma bovigenitalium, California mycoplasma, Alcaligenes mycoplasma and Mycoplasma bovirhinis) specific PCR, the results of 98.06% positive samples (101/103) bovine mycoplasma, 1.94% (2/103) for the production of alkali did not detect other Mycoplasma mycoplasma. These results indicate that mycoplasma is prevalent in dairy cows, and mycoplasma is the dominant mycoplasma. In order to rapid and simple detection in milk samples, using the advantage of Mycoplasma Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovis uvrC gene as target detection, design a set of LAMP primers, by optimizing the experimental conditions, the establishment of LAMP method for detection of bovine mycoplasma specific. 11 strains (12 strains) of Mycoplasma and 4 strains (4 strains) of bovine origin bacteria were detected. The results showed that all of the other pathogens were negative except bovine body, indicating that this method has good specificity. The sensitivity test showed that this method could detect the genome of Mycoplasma bovine with the lowest level of 1 pg. Mycoplasma bovis LAMP detection method established in this experiment, only need to complete the reaction heat an hour at 61 degrees, after the completion of the reaction SYBR Green 1 color liquid can be directly according to the change of the color with the naked eye examination results, a simplified fit in the rapid detection of Mycoplasma bovis application of basic detection method.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 侯明學(xué),周正清,毛德榮,顧春云;羊肺炎支原體病的診治[J];云南畜牧獸醫(yī);2000年02期

2 ;鷓鴣支原體病的防治[J];技術(shù)與市場;2001年05期

3 何建軍,劉宏玉,詹繼英,夏生福;鷓鴣支原體病的診治[J];甘肅畜牧獸醫(yī);2002年01期

4 姜勝飛,南文金,高斌文,孫彥亭,王志鵬,楊霞,盧中華;雞支原體病的診治[J];河南畜牧獸醫(yī);2002年12期

5 凌云,劉天龍;鷓鴣支原體病的防治[J];農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與技術(shù);2002年07期

6 朱來華,王樹峰,魏乃林,吳華,于紅光;禽支原體病的檢疫及病禽的處理[J];山東畜牧獸醫(yī);2003年05期

7 李政,杜崇濤;豚鼠支原體病初步診斷[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2004年02期

8 張發(fā)成,郭進(jìn)安,李晶,李彥嶺,李普賓,郭素玲;我市家畜發(fā)生血液支原體病的現(xiàn)狀與防治[J];中國動物檢疫;2004年04期

9 張發(fā)成,郭進(jìn)安,李晶,李彥嶺,李普賓,郭素玲;河南省濮陽市家畜發(fā)生血液支原體病的現(xiàn)狀與防治[J];肉品衛(wèi)生;2004年06期

10 李有業(yè);雞支原體病及其預(yù)防高效制劑[J];中國家禽;2004年22期

相關(guān)會議論文 前10條

1 糜祖煌;秦玲;;五種支原體聯(lián)合分子檢測在支原體病診斷中的應(yīng)用[A];第五屆全國優(yōu)生科學(xué)大會論文匯編[C];2000年

2 謝海剛;溫敬娟;;雞支原體病的診斷與防治[A];“科技支撐高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全現(xiàn)代畜牧業(yè)”論文集[C];2012年

3 韓瀟瀟;陳穎鈺;郭愛珍;;牛支原體相關(guān)疾病綜合防治措施[A];第四屆全國牛病防制及產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會論文集[C];2012年

4 王金玲;丁玉林;李平安;黃海碧;馮超;吳建美;王鳳龍;;犢牛支原體性關(guān)節(jié)炎的診斷[A];2012年中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分會暨中國病理生理學(xué)會動物病理生理專業(yè)委員會學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

5 張秀美;M.I.Khan;;PCR技術(shù)在禽支原體診斷上的發(fā)展和應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2002年

6 邵國青;;我國主要動物支原體病研究述略[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展（下冊）[C];1999年

7 胡長敏;石磊;龔瑞;白智迪;郭愛珍;;牛支原體病研究進(jìn)展[A];中國奶業(yè)協(xié)會第24次繁殖學(xué)術(shù)年會暨國家奶牛/肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系第一屆全國牛病防治學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

8 郭夢堯;王國卿;張乃生;楊正濤;劉文博;;病死犢牛呼吸系統(tǒng)內(nèi)支原體的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2010年學(xué)術(shù)年會——第二屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集(上冊)[C];2010年

9 張秀美;;PCR技術(shù)在禽支原體診斷上的發(fā)展和應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集（下）[C];2003年

10 常繼濤;于力;;Leachii支原體病的研究現(xiàn)狀與展望[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 ;支原體特效合劑[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

2 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;雞支原體病的防制[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

3 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;禽呼吸道支原體病[N];中國畜牧報(bào);2002年

4 林立;鷓鴣支原體病的防治[N];山西科技報(bào);2001年

5 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;禽呼吸道支原體病[N];中國畜牧報(bào);2002年

6 朱其太 連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局;雞支原體病的預(yù)防和治療[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

7 ;雞支原體病的防制[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

8 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;雞支原體病的防治[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

9 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;禽呼吸道支原體病[N];中國畜牧報(bào);2002年

10 楊博;冬季雞支原體病咋防治[N];山西科技報(bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前6條

1 袁聰俐;豬嗜血支原體病原特性、流行特點(diǎn)及與宿主互作機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2009年

2 郭子晟;鴨和鴿支原體基因組測序及比較基因組學(xué)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 魏順;衣阿華支原體與滑液支原體的全基因組測序及分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 李佳禾;牛支原體表達(dá)載體的構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 張秀英;單諾沙星在健康和支原體-大腸桿菌感染雞的藥動學(xué)與藥效學(xué)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

6 徐春光;絲狀支原體PG3株和綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙分離株基因組測序及可變表面脂蛋白基因克隆表達(dá)[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楊銘偉;牛支原體滅活疫苗的研制與免疫效果研究[D];石河子大學(xué);2015年

2 胡國明;基于脂蛋白P48的牛支原體快速檢測方法的建立[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 王永威;豬嗜血支原體SYBR Green qPCR檢測方法的建立及應(yīng)用[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 李娜;牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶基因的克隆表達(dá)及缺失株的構(gòu)建[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 蘇煒德;牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基基因的克隆、原核表達(dá)及α亞基單克隆抗體的制備[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 張瑞;牛支原體弱毒疫苗的篩選及臨床評價(jià)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 雷元元;牛支原體滅活疫苗的研究[D];寧夏大學(xué);2016年

8 高航飛;牛支原體NM2012株生物學(xué)特性研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

9 馮廣余;綿羊肺炎支原體滅活疫苗的研制及免疫效果的評價(jià)[D];石河子大學(xué);2016年

10 秦明明;牛奶中支原體的檢測及牛支原體LAMP診斷方法的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

，

本文編號：1345594