發(fā)布時(shí)間：2017-12-25 05:04

  本文關(guān)鍵詞：PK-15細(xì)胞與三種益生菌共培養(yǎng)抗TGEV作用及IFN-γ、IL-6mRNA表達(dá)　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 豬傳染性胃腸炎病毒 益生菌 PK-15細(xì)胞 共培養(yǎng) 抗TGEV

【摘要】：豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)可以感染各種年齡和品種的豬,尤其是兩周齡以內(nèi)的仔豬,其死亡率高達(dá)100%,嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水為主要的臨床特征,是引起仔豬腹瀉的重要病原體,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重威脅其健康發(fā)展。益生菌具有提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和治療腹瀉等疾病的作用,因而在畜牧業(yè)受到廣泛地關(guān)注。為了模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境,探究細(xì)胞與益生菌間的相互作用對(duì)于維持生理穩(wěn)態(tài)以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的影響,鑒于PK-15細(xì)胞是TGEV的易感細(xì)胞,所以本實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室在體外建立PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)模型,通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色摸索該共培養(yǎng)體系加入益生菌菌體的濃度、PK-15細(xì)胞與益生菌的共培養(yǎng)時(shí)間等條件。以共培養(yǎng)體系為平臺(tái),接入TGEV通過(guò)MTT比色法檢測(cè)其抗TGEV效果,初步研究益生菌-細(xì)胞-病毒三者之間的相互作用關(guān)系。此外,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PK-15細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6 m RNA的表達(dá)量,探索細(xì)胞在益生菌作用下的抗病毒效應(yīng)。在體外PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)模型中,通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)不同益生菌菌體濃度和不同共培養(yǎng)時(shí)間組合條件下PK-15細(xì)胞的存活率,結(jié)果表明:不同的益生菌菌體濃度、不同的共培養(yǎng)時(shí)間,PK-15細(xì)胞的存活率不同。當(dāng)c≤108 CF U/m L且t≤24 h時(shí),P K-15細(xì)胞的存活率較高,達(dá)90%以上;當(dāng)c≤1012 CF U/m L且t≤3h時(shí),P K-15細(xì)胞的存活率可達(dá)80%以上,即在上述兩種情況下,PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)成立。用MTT比色法檢測(cè)不同濃度的益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)3 h及濃度均為108 CF U/m L的益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間,其共培養(yǎng)的抗TGEV效果,結(jié)果表明:在PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)體系中,當(dāng)益生菌的濃度約為108 CF U/m L及當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到12 h左右對(duì)TGEV的抑制率較高,因此108 CF U/m L為益生菌的最佳濃度,12 h為P K-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)的最佳時(shí)間,并且兩種情況下,對(duì)TGEV的抑制程度均為:枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)組屎腸球菌共培養(yǎng)組食淀粉乳桿菌共培養(yǎng)組。濃度為108 CF U/m L的益生菌與P K-15細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后接種TGEV,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TGEV滴度,其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對(duì)數(shù)的變化曲線隨時(shí)間的增加,呈先上升后下降的趨勢(shì)。在PK-15細(xì)胞與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)體系中,當(dāng)收集TGEV時(shí)間點(diǎn)為48 h時(shí),其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的負(fù)對(duì)數(shù)達(dá)到峰值為3.87;在PK-15細(xì)胞與屎腸球菌共培養(yǎng)體系中,當(dāng)收集TGEV時(shí)間點(diǎn)為24 h時(shí),其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的負(fù)對(duì)數(shù)達(dá)到峰值為5.16;在PK-15細(xì)胞與食淀粉乳桿菌共培養(yǎng)體系中,當(dāng)收集TGEV時(shí)間點(diǎn)為48 h時(shí),其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的負(fù)對(duì)數(shù)達(dá)到峰值為4.55。在共培養(yǎng)體系中,每個(gè)處理組的TGEV的平均滴度均小于正常病毒組,因此PK-15細(xì)胞與益生菌共培養(yǎng)能降低TGEV的滴度,降低程度為:枯草芽孢桿菌組屎腸球菌組食淀粉乳桿菌組。將六孔細(xì)胞培養(yǎng)板鋪滿單層的PK-15細(xì)胞進(jìn)行如下分組處理:正常細(xì)胞對(duì)照組(Control組)、TGEV感染組(TGEV組)、與濃度為108 CF U/m L枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)12 h組(BS+Cell組)和與濃度為108 CF U/mL枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)12 h后感染TGEV組(BS+Cell+TGEV組)然后分別在1 h、3 h、6 h、12 h、24 h收集PK-15細(xì)胞樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組PK-15細(xì)胞中IFN-γ和IL-6 mRNA表達(dá)量的變化,結(jié)果表明:PK-15細(xì)胞與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)后感染TGEV能刺激IFN-γ和IL-6 m RNA表達(dá)量增加,作用效果為先快速增加,后逐漸減小。BS+Cell+TGEV組在3 h、6 h時(shí)均顯著刺激IFN-γm RNA表達(dá)量增加,在1 h、3 h時(shí)均能顯著刺激IL-6 m RNA表達(dá)量增加,在3 h時(shí)IFN-γ和IL-6mRNA表達(dá)量達(dá)到最大值。TGEV和枯草芽孢桿菌也都能刺激PK-15細(xì)胞IFN-γ和IL-6 m RNA表達(dá)量增加,并與BS+Cell+TGEV組有相同的趨勢(shì),但TGEV組和枯草芽孢桿菌組只在6 h時(shí)顯著刺激IFN-γm RNA表達(dá)量增加,TGEV組只在3 h時(shí)顯著刺激IL-6 m RNA表達(dá)量增加,枯草芽孢桿菌組只在1 h時(shí)顯著刺激IL-6 mRNA表達(dá)量增加,并達(dá)到最大值,且均低于BS+Cell+TGEV組。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1331440